提高PEDV疫苗免疫效果的关键点分析

李少丽，胡晓凤，康 斌，王家福，尹忠良

（杭州佑本动物疫苗有限公司，浙江杭州 310018）

1 猪流行性腹泻概述

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是一种由冠状病毒科的猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的高度接触性肠道传染病，主要特征为猪呕吐、水样腹泻、脱水，哺乳仔猪病死率可高达80%～100%。PED是目前导致哺乳仔猪发生腹泻最主要的疫病，可对全球的养猪业造成巨大的经济损失[1]。PEDV可通过母乳、粪-口途径、污染的饲料、器具及气溶胶传播，防控难度较大[2]。

PEDV由约28 kb的单链正义RNA基因组构成，其中包括编码纤突糖蛋白（S）、囊膜蛋白（E）、N-糖基化膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）等4个结构蛋白。S蛋白含1 383个氨 基 酸，约180～220 kDa，分 为S1（1～726 aa）和S2（727～1 386 aa）两个亚基（以CV777为例）。S1亚基含受体结合域，可促进病毒与受体的结合；S2亚基负责病毒与细胞膜的融合，S蛋白在介导病毒感染宿主产生中和抗体过程中发挥重要作用[3]。全基因组序列进化树分析显示，PEDV可分为2类：包括2010年以前出现的经典毒株（G1群）以及目前主要流行变异毒株（G2群）；两个群又可分为两个亚类：1a和1b、2a和2b，不同基因型以及亚型之间的交叉保护存在差异[4]。

1971年，英国首次报道了猪群中发生PED疫情[5]，但未分离到PEDV。1978年，研究证实PEDV CV777株是引起PED发生的主要原因[6]。1970—1980年间，PED在欧洲广泛流行，哺乳仔猪损失惨重[7]。1973年，我国上海发生PED疫情[8]。1994年，PEDV CV777毒株灭活和减毒活疫苗上市。1999年以来，我国猪群广泛应用PED、猪传染性胃肠炎二联灭活疫苗及减毒活疫苗防控猪的腹泻，直至2010年，我国猪场PED多呈散发，无大规模暴发的报道。

2010年冬季，我国南方超过10个省份的猪场暴发了PED，造成100万头以上仔猪死亡，病死率80%～100%，即使接种了猪流行性腹泻（CV777）、猪传染性胃肠炎二联灭活疫苗的仔猪病死率也高达50%～100%，对养猪业造成一定的打击[8]。Sun等[9]对2010—2011年在中国大规模暴发PED猪场的177份病料样本进行RT-PCR检测，结果显示，共有125份样本呈PEDV阳性，阳性率70.6%；S基因的遗传进化分析结果显示，所检测PEDV S基因同源性为99.1%～100.0%，与CV777疫苗株同源性94.5%～95.1%，且在S蛋白区域有9个氨基酸突变。Li等[10]对我国不同省份的数十个猪场进行PEDV病原监测发现，2010年以后流行的PEDV与经典CV777毒株的S基因相似性为93%，主要流行变异PEDV毒株的S基因发生突变。目前，G2群成为国内外猪场PEDV的主要流行毒株[11-13]。

根据免疫猪群的发病以及PEDV S基因的变异，推断PEDV疫苗毒株无法对流行毒株产生完全的免疫保护。虽然防控疫情不应只靠疫苗，但免疫疫苗能够提升猪群群体抵御野毒攻击水平，大幅降低因管理漏洞而造成发病的概率。因此，开发与流行毒株基因同源性更高的疫苗仍是防控腹泻的重要途径。

2 提高PEDV疫苗免疫效力的关键点

PED常与猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒混合感染。我国商品化的PED疫苗主要是联苗，如猪流行性腹泻（CV777或PEDV流行毒株）、猪传染性胃肠炎二联活疫苗和灭活疫苗以及猪流行性腹泻（CV777）、猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒三联活疫苗。国外则以PED单苗为主，如日本的减毒活疫苗（83P-5株）、韩国的SM98-1株减毒活疫苗或灭活疫苗、适于口服的DR13株减毒活疫苗[14-16]，还有美国使用甲病毒RNA复制子制备的PED核酸疫苗及硕腾的PED全病毒灭活疫苗等[17]。

以PEDV灭活疫苗单苗为例，生产疫苗时，首先应筛选出免疫原性强且安全性好的疫苗毒株，将筛选的疫苗毒株按照一定比例接种适宜的细胞，经转瓶或生物反应器等批量培养，收获细胞培养物，经灭活处理与佐剂按一定比例混合乳化制成。

2.1 选择与PEDV流行毒株交叉保护能力强的疫苗毒株

疫苗毒株的选择是影响疫苗免疫效果最主要的因素。通常在发生病毒性传染病时，应优先选择针对流行毒株的疫苗；PED疫苗也不例外，交叉保护能力是疫苗毒株选择的首要标准。

不同基因型及亚型PEDV毒株之间的交叉免疫保护效果不同，PEDV G1型毒株疫苗对G2型毒株的攻击无法或仅能够产生部分免疫保护。Sato等[18]采用G1型PEDV活疫苗（P-5V株）免疫妊娠母猪，其所产仔猪采用G2型PEDV攻毒，仔猪存活率为80%，而不免疫对照组母猪所产仔猪存活率为0。也有研究表明，G1a型疫苗（CV777和DR13）对G2b型YC2014的免疫保护为0[19]。与CV777等G1型毒株相比，G2型变异毒株制备的疫苗可能具有更好的交叉保护能力。Zhang等[20]采用G1a型（CV777）和G2a型（CH/JX/01）PED灭活疫苗分别免疫母猪2次，对其所产仔猪分别以G1型的CV777和CH/JX/01攻击；结果显示，G2a型灭活疫苗可对同源和异源PEDV的攻击提供坚强的免疫保护，而G1a型灭活疫苗仅能够对同源毒株CV777诱导良好的免疫保护，对异源G2a PEDV CH/JX/01毒株的攻击只提供部分保护。

Liu等[21]对分离的PEDV G2a和G2b毒株制备疫苗进行了交叉免疫保护试验，根据攻毒仔猪的临床症状和粪便排毒进行判定是否保护；结果显示，G2a型灭活疫苗对所有仔猪的同源G2a型毒株CH HBXT/2018-P4和异源G2b CH HNPJ/2017-P4病毒攻击均可起到保护作用，G2b株灭活疫苗对相应同源和异源病毒攻击保护率分别为50%（2/4）和25%（1/4），表明G2a型PED灭活疫苗的交叉免疫能力更强。Tanja等[22]采用PEDV强毒（G2b）对7个月前感染PEDV弱毒（G1b）的母猪所产3日龄仔猪攻毒，结果显示，仔猪存活率100%，而早期未感染母猪所产仔猪的存活率只有67%。因此，不同地区猪场应根据当地流行的PEDV情况选择交叉免疫保护性强的毒株制备疫苗。

2.2 提高PED疫苗中的抗原含量

疫苗中的抗原含量也是影响疫苗免疫效果的关键因素。Collin等[23]采用荧光聚焦中和试验和ELISA方法检测采用不同PEDV抗原含量疫苗两次免疫的试验猪所产生的抗体水平，结果显示，108TCID50/mL组抗体水平均明显高于106TCID50/mL组。而在疫苗中抗原含量一定的情况下，增加接种剂量也可提高疫苗的有效性。Arriba等[24]对11日龄试验猪分别口服低、高剂量的CV777活疫苗，并于免疫21 d后采用PEDV强毒攻击；结果显示，50%的高剂量接种试验组猪未检出病毒，而低剂量组只有25%的试验猪无法检出病毒。

目前，通常将PEDV按一定比例接种于长满良好单层的Vero细胞，加入含2～20μg/mL胰酶的DMEM维持液培养以提高疫苗抗原含量。1988年，Hofmann等[25]在Vero细胞的培养液中加入胰酶，成功复制出PEDV。胰酶在促进PEDV进入细胞和释放出细胞过程中的重要作用得到证实，胰酶能够使Vero细胞培养液中PEDV的病毒量比不加胰酶时提高100～1 000倍[26]。在Vero细胞培养液中添加胰酶或胰酶替代物已成为PEDV细胞培养的通用方法。然而，胰酶对于一些高度适应细胞生长的PEDV的繁殖并非必需，不添加胰酶时，PEDV的感染效率反而可能提高至108TCID50/mL[27-28]。

2.3 控制PEDV疫苗种毒传代次数

随着PED疫苗种毒体外传代次数增加，其对细胞的适应能力增强，但对猪肠道细胞的感染能力降低。有研究使用亲代与经Vero细胞培养至第93代的PEDV（DR13株）制备的疫苗，间隔21 d两次口服接种母猪，并采用10 mL 108.0TCID50/mL的PEDV攻击接种F93代PEDV疫苗的母猪所产的4头仔猪；结果显示，仔猪仅表现一过性厌食和轻微腹泻症状并于2～3 d内恢复正常，而亲代PEDV免疫猪则在攻毒后2～3 d出现典型的腹泻症状，病死率可达10%～100%，表明PEDV分离株经多次细胞传代后对猪的感染力降低[29-30]。Chen等[31]给试验猪口服接种YN15（传代15次）或YN144（传代144次）的YN1毒株，结果显示，所有感染YN15的仔猪均死于严重腹泻，而YN144几乎没有感染猪的肠上皮细胞且接种仔猪未出现肉眼可见病变，推断当PEDV体外适应Vero细胞培养后，其在猪肠上皮细胞中感染和复制的效率降低。控制PEDV的体外传代次数是提高其体内繁殖能力的保障。因此，生产PED活疫时应控制疫苗种毒的传代次数，维持疫苗中PEDV抗原含量与其在猪体内繁殖能力的平衡。

2.4 制定合理的疫苗免疫程序

PEDV感染主要引起10日龄以内仔猪死亡，对仔猪接种疫苗进行主动免疫难以在短时间内形成有效保护，只能够以疫苗免疫母猪群，母猪通过乳汁将分泌型免疫球蛋白A（sIgA）与免疫球蛋白G（IgG）抗体传递给仔猪，仔猪获得被动保护。sIgA在保护动物免受PEDV感染方面比IgG或免疫球蛋白M（IgM）更有效，且感染仔猪血清中IgA的抗体水平与口服接种母猪乳汁中的IgA抗体水平呈正相关[22]。因此，提高仔猪血液或母猪乳汁中sIgA的抗体水平成为保障疫苗有效性的关键。

PED活疫苗口服免疫和自然感染（含人工感染）是刺激猪群黏膜免疫系统产生sIgA的重要途径[23]。Song等[16]对PEDV阴性的妊娠母猪口服接种PEDV减毒活疫苗（DR13株）；结果显示，与注射免疫相比，此种免疫方式可使哺乳仔猪的病死率降低47%。

在PED暴发期，猪场一般采用返饲的方法防控PEDV。返饲相当于人工感染PEDV，即将发病12～24 h内仔猪的肠组织和肠道内容物研磨成匀浆，加入适量抗生素，按一定比例饲喂母猪，使母猪群快速建立整齐的免疫应答，进而保护哺乳仔猪免受PEDV感染。与肌肉注射PED疫苗的母猪相比，返饲的母猪可表现出更高水平的sIgA抗体，同场一周内即可快速控制疫情，给母猪注射高剂量且毒力更强的PEDV可提高其仔猪的存活率[32]。但返饲的病料是强毒，未经灭活，可能含有猪伪狂犬病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征（PRRSV）等其他强毒或致病菌，存在疫情暴发的风险，故不提倡使用。

对于安全性好的PED灭活疫苗，虽通常不会引起阴性猪激发sIgA，但因感染PED的猪肠道免疫系统已被激活，再次免疫PED灭活疫苗或减毒活疫苗，不仅能够再次激活sIgA，还能够使sIgA的分泌产生放大效应；并且PED灭活疫苗作为加强免疫的效果优于减毒活疫苗，能够刺激产生高水平的IgG及IgA抗体。因此，母猪两次免疫PED灭活疫苗或将PED灭活疫苗接种PEDV感染过的猪能够产生很好的免疫效果。

综上所述，利用PED活疫苗及灭活疫苗的免疫特点，制定合理的免疫程序，可使疫苗在防控疫情方面起到最大限度的保障作用。因各猪场PEDV感染状态不同，其PEDV疫苗的免疫程序必定存在差异。对PED疫苗大致免疫程序为：后备母猪于配种前间隔30 d左右免疫2次；经产母猪于产前40 d、产前20 d各免疫1次，免疫母猪所产仔猪于断奶后7～10 d接种1次；疫病多发季节或紧急免疫时，全群种猪普免1～2次。

3 结论

PED是当前除非洲猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征外，导致我国猪群发病最主要的一类动物疫病。2010年，变异PEDV使我国猪场暴发流行性腹泻，接种CV777疫苗的猪场也未能幸免，经典CV777疫苗已无法对变异PEDV毒株产生完全的免疫保护，开发基于PEDV流行毒株的疫苗成为研究热点。

从疫苗的角度考虑，提高PEDV疫苗免疫效力存在以下关键点：选择与PEDV流行毒株交叉保护能力强的疫苗毒株，G2型比经典G1型PEDV毒株疫苗的交叉免疫保护效果要好；提高PED疫苗中的抗原含量，如PEDV细胞培养时加入一定浓度的胰酶，促进PEDV对细胞的感染和释放；控制PEDV疫苗种毒传代次数，在保证疫苗中含足够抗原含量的同时，不影响PEDV在猪体内的繁殖能力；充分利用PED活疫苗及灭活疫苗的特点，制定合理的免疫程序。对于已经感染PEDV或免疫PED活疫苗的猪场，PED灭活疫苗作为加强免疫的效果要优于减毒活疫苗，能够刺激高水平的IgG及IgA抗体产生。

综上所述，对于PED的防控除了要提高疫苗本身的免疫效力，还要做好饲养管理和生物安全，各方面工作应更加规范、全面，提高母猪的生产性能，有效保障猪场生产效益的稳定。