小反刍兽疫诊断技术和疫苗研究进展

索郎扎西

（西藏自治区兽医生物药品制药厂，西藏拉萨 850003）

小反刍兽疫简称为PPR，该病具有接触传染性以及严重的烈性等特征，被FAO/OIE归为A类烈性传染病，我国则规定PPR为一类动物疫病。PPR的病原体为PPRV小反刍兽疫病毒，与RPV牛瘟病毒一样均属于副黏病毒科麻疹病毒属[1]。曾经PPRV被错认为是由于RPV变异所得来的病株，PPRV与RPV能产生交叉免疫保护机制，因此PPR的预防常使用牛瘟疫苗。直到上世纪70年代后才被证明PPRV与RPV之间的区别和差异所在。

PPRV的主要感染对象为小反刍兽，山羊则是小反刍兽中最容易感染的群体，不同品种山羊感染的几率、程度均不同。经研究发现PPRV更倾向于感染欧洲品系的山羊，幼龄动物以及哺乳期的动物其易感程度更强[2]。同时发现猪牛两种动物群体也可能会感染，但不会伴随临床症状。

此外，PPRV还能够克服大型反刍动物，破坏其先天抵抗力对水牛、骆驼造成感染。当动物感染PPRV之后，临床典型特征表现为口舌溃疡、高热、支气管肺炎、严重腹泻、眼鼻分泌物增多、流泪，其感染程度严重时发病率及病死率为100%，且该病尚未研发出完全诊治的治疗方法，仅通过疫苗免疫以及早期诊断来控制病情的发生和发展[3]。

1942年在非洲的科特迪瓦发生了世界上第一例PPR病例。本病曾经严重危害到中东、非洲等地区，直至2006年年初，巴基斯坦、尼迫尔、孟加拉国、印度等位于我国周边的国家均爆发PPR疫情，在过后几年疫情呈现增长的趋势[4]。2007年7月我国在西藏地区发生了首例小反刍兽疫，经过国家外来动物疫病诊断中心的诊断后确诊为PPR疫病。

1 PPRV结构概述

PPRV是一种属于副黏病毒科麻疹的病毒。对麻疹病毒属病毒基因的保守性问题研究发现，L和M是高度保守的基因，非编码区为易变异区，如M和F基因之间富含GC区域。

PPRV粒子是一种呈圆形且在病毒包膜里为核衣壳状态，组成成分为P磷蛋白、L大蛋白、N核衣壳蛋白。N蛋白是N基因编码所编制，包含一个ORF开放阅读框，氨基酸残基能够编译出525个。N蛋白中含有细胞毒性T淋巴细胞抗原位点，是由九个氨基酸所组成的，能够诱导机体产生受I型MHC分子，对CTL反应造成限制[5]。P蛋白在RNA聚合酶复合物中，是一种辅助因子，在结合L蛋白后，能够更好的折叠L蛋白。核衣壳蛋白和P蛋白结合后能够保持P蛋白在细胞质中维持可溶状态，组织蛋白出现补非特异RNA结合或者不正常装配的情况。P蛋白是一种最不保守的蛋白。病毒囊膜的内层则由M蛋白形成。细胞在释放成熟病毒粒子的过程当中，M蛋白有着关键性的作用。M蛋白处于缺损状态的时候，病毒无法稳定持续发挥感染功能。F蛋白含有546个氨基酸，是一种融合蛋白，分子量为59KD，与病毒之间的关联在于其参与了细胞融合和感染的开始以及介导的溶血过程。病毒的另一种纤突由H蛋白构成，该蛋白的作用在于具备神经氨酸酶活性以及血凝素，其变异性较高，并含有T细胞抗原决定簇[6]。

2 国内研究发展现状

目前对小反刍兽疫病的研究我国尚处于初始起步阶段。随着近年来禽流感、SARS等大规模国际性人畜传染病的爆发，我国周边地区PPR开始蔓延，这也引起了国内的高度重视。中国检疫检验科学研究院、中国农业科学院、云南出入境检验检疫局、中国动物卫生与流行病学中心以及北京畜牧兽医研究所等单位展开了关于疫病的相关研究，以检验检疫技术为主要目的，建立了检测小反刍兽以病毒核酸的方法，主要采用RT-PCR检测法，研究重点同时 进行克隆N、H基因和原核以及真核表达。在此之后又以核酸检测技术为基础，引入巢式PCR技术，从第一次PCR产物作为基础开展二次PCR，提高反应特异性[7]。

3 诊断技术

3.1 琼脂凝胶免疫扩散试验

琼脂凝胶免疫扩散的简称为AGID，该试验广泛应用与临床中，原因在于其具有诸多优势如便宜经济适用、方法简单易于操作，不仅能够在基层实验室操作，其不受空间的限制在野外也可操作，反应18～24 h之后便可取得结果。但对于临床中较为常见的温和型PPR，AGID试验不具备对应的敏感性来检测分泌物中含量较低的抗原， 因此不适合用于处于PPR早期的诊断。

3.2 间接荧光抗体试验

通过PPRV的单克隆抗体建立IFAT间接荧光抗体试验，该试验能够有效检测出早期以及晚期病料中的PPRV。除此之外以重组的PPRVF蛋白作为抗原，对家兔进行免疫，制备多克隆抗体为一抗能够捕获病料中的抗原，二抗则是从抗兔体内的IGG提取，通过IFAT能将PPRV诊断出。

3.3 对流免疫电泳

通过CIEP和AGID对流免疫电泳的检测方法联合使用来检测PPR病料，发现AGID的检测阳性率仅为42.3%，而CIEP的检测率高达80.6%，说明CIEP的敏感性更高。Osman等用CIEP及竞争ELISA（c-ELISA）两种方法对520个血清样本进行同时检测，结果发现CIEP的阳性率为59.15%，高于c-ELISA的50.67%阳性率。对比下来CIEP的敏感性又比c-ELISA高，但是CIEP试验存在一个明显的缺陷，无法区分RPV和PPRV感染。但由于CIEP所具备的敏感性较高，可以在无条件开展c-ELISA的实验室或者地区作为筛选试验，在临床上用于检测PPRV[8]。

3.4 中和试验

VNT中和试验是国际贸易所唯一指定诊断PPR的方法，该方法的优势在于具备较强的特异性和高灵敏性，但其缺点在于所需时间较长，通常要10～12 d才能出诊断结果，其次所要具备的试验要求较高，无法适用于大规模样品检测。其转管培养通常应用于非洲绿猴的肾细胞或者原代羔羊肾细胞，与RPV做交叉中和试验，能够有效鉴别诊断出RPV。

3.5 病毒分离鉴定

培养分离PPRV时可选用两种细胞，分别为原代羔羊肾细胞以及非洲绿猴肾细胞，病毒培养5～6 d后细胞形态会发生变化，逐渐变圆并收缩，最终形成合胞体。细胞核的形状为圆形，排列如表盘状。CPE出现时间较长，5～6 d后会开始盲传继代，此时需要借助电子显微镜或者VNT病毒中和试验来进一步进行鉴定。该方法的缺点在于对试验要求较高，且需要投入大量的物力、人力，不适用于基层实验室应用开展检测[9]。

3.6 核酸探针杂交试验

目前可以通过建立核酸探针杂交检测的方法来检测PPRV各个基因。针对PPRVN蛋白基因所够贱的CD-NA探针能够有效对PPRV以及RPV区分鉴别，但其缺点在于放射性元素危害较大且32P半衰期较短，因此核酸探针杂交试验的方法不具备广泛应用与临床、实验室的诊断方法。

3.7 ELISA

ELISA用于检测血清的方法在临床上已经得到广泛应用，且发展十分成熟并具有多种试验方法。

3.7.1 竞争ELISA

动物血清收到PPRV感染之后会产生H蛋白及PPRVN蛋白的抗体用以针对PPRV，c-ELISA由单克隆抗体作为基础所建立研发的检测方法。除此之外，大肠杆菌中可以提供RPV碳端可变区表达的条件，生成c-ELISA抗原，鉴别诊断RPV和PPRV的具体感染情况。c-ELISA是一种标准的OIE检测方法，目前已经研发出c-ELISA检测试剂盒，血浆或血清均可通过c-ELISA检测试剂盒来检测完PPRVN蛋白抗体。这种方法的优点在于耗时短，能够大量化时间检测，且敏感性和特异性的数据表现都十分优秀，敏感性高达94.5%，特异性则高达99.4%。因此该方法得到临床的广泛应用。

3.7.2 夹心ELISA

S-ELISA夹心ELISA方法是对临床样品通过多克隆抗体来捕获PPRV抗原，用单克隆抗体来检测从样品中捕获的抗原。根据相关试验数据报道发现，S-ELISA的特异性和敏感性均低于C-ELISA，数据分别为92.8%和88.9%，但在2h内即可获得试验结果，该方法尤其适合用于临床的检测，缺点在于无法鉴别RPV；S-ELISA具备操作简单、检测迅速的优势，可以替代VNT作为PPR疫苗质量控制的方法。

3.7.3 间接ELISA

血清中存在多抗，为应对这种情况建立了IELISA间接ELISA的方法，敏感性和特异性的表现都很优秀，分别达到90.81%以及95.09%，zhang等克隆了在西藏爆发的疫情中感染动物的PPRVN蛋白基因，于大肠杆菌中进行表达，以此为基础建立了iELISA方法，对697份血清进行分析后得出特异性和敏感性的数据，分别为96.1%和96.7%。经过对比分析后发现，PPRV的NP蛋白中位于452-472区域的多肽序列具备特异性，且免疫原性更强，产生的抗体能够精准特异识别PPRV，可用于鉴别诊断RPV和PPRV。该方法具备高敏感性和特异性能够有效替代国外昂贵的试剂盒，将其应用于实验室中诊断PPR。

3.8 PCR-ELISA

PCRELISA检测方法是由Saravana等基于PPRVN基因建立了。对336 bp产物通过RT-PCR扩增地高辛进行标记，然后使用ELISA进行检测，该方法相较于传统的RT-PCR检测法灵敏度高出10000倍，在检测临床样本的过程中发现，该方法的敏感度远高于S-ELISA。对于处于早期感染以及感染后期PPRV，使用PCR-ELISA更加适合，同时还具备鉴别诊断RPV和PPRV的功能。

3.9 聚合酶链式反应

针对 N、 M基因的一步法Balamurugan 等建立了RT-PCR多重聚合酶链式反应方法。该方法能够鉴别诊断RPV。Georg等基于PPRV N、H、M 蛋白基因建立了多重RT-PCR方法，研究结果发现敏感性中最高的便是M基因的PCR，N、H、F的敏感性则逐次降低，均可鉴别诊断RPV和PPRV。一步法实时定量RT-PCR法是一种基于PPRV N蛋白基因所研发的方法，能够检测血液样本，相较于RT-PCR而言，其具有更高的敏感性并能够减少PCR所带来的污染。PCR具有检测耗时短、灵敏性高、特异性强且具备高通量等优势，值得应用于诊断PPRV。

4 疫苗研究进展

4.1 PPR弱毒疫苗

上世纪八十年代末首次研究出针对PPRV毒株致弱的方法，从非洲绿猴肾细胞中所获取的，该株疫苗属Ⅰ群，因为具有较强的交叉保护作用，且不存在毒副作用而广泛应用与预防PPR中。该疫苗可进行干燥冷冻处理，经过处理后的疫苗获得高热稳定性，因此能够在基层运输汇总广泛应用。在机体获得面以后能够维持12个月的保护性抗体，母源抗体较高在4～5月龄实现首次免疫；该疫苗的缺点在于无法区分疫苗毒和野毒。除此之外，在经过细胞致弱后，PPRV毒株采用C-ELISA方法能够检测出体内较高的水平抗体，且能够维持一年之久。

4.2 RPV弱毒疫苗

RPV弱毒疫苗曾用于山羊和绵羊的免疫，不但能够预防PPR且能够控制RP，具有较好的免疫保护效果，云隐在于RPV和PPRV之间具有较高抗原相关性。该疫苗的缺点在于不利于用于认证RP的无疫。Walsh等在牛瘟弱毒RBOK疫苗株中插入GFP绿色荧光蛋白基因，构建成经过充足的病毒RPV-SIGGFP。接种后，不会受到PPRV和RPV的感染，并且产生的抗体能够区别疫苗免疫动物和自然感染动物。

4.3 重组亚单位疫苗

无需使用佐剂，用重组杆状病毒表达的HN蛋白即可产生RPV和PPRV的抗体。绵羊口服后产生中和抗体。相较于PPR弱毒疫苗而言具有更稳定的耐热性能，且时效长，因此可用于PPR防控。

4.4 嵌合体疫苗

嵌合体疫苗是通过代替PPRV中的蛋白基因所形成的。在用该疫苗免疫山羊后并未出现不良反应，且体内产生水平较高的中和抗体，能够有效抵抗PPRV强毒。

4.5 山羊痘活载体疫苗

用于小反刍兽疫以及羊痘预防的疫苗均使用的弱毒疫苗，存在一定的隐患如散毒性。重组羊痘病毒面以后则功效得以极大的提升，不但能够预防感染CPV还能抵抗感染PPR。研究发现重组后的rCPVPPRVF能够产生更强的免疫能力，首次注射后便可取得80%的抗体产生有效率，6个月后仍能从体内检测到中和抗体，其作用时间长可以作为发展小反刍兽疫苗的趋向。

4.6 RNA干涉技术

利用杆状病毒载体和重组腺病毒来表达小干扰RNA，可治疗RPV感染和PPRV感染。重组病毒可以对病毒的复制进行有效抑制。相关研究结果发现在对抗麻疹病毒感染的治疗中SiRNA分子有着巨大的潜在价值。

5 小结

PCR和c-ELISA检测技术均具备特异性强、检测快速、通量性高、灵敏性高的有点，因此可用作为检测OIE的标准检测方法，基因工程疫苗则能够有效发挥控制小反刍兽疫的作用。