降解亚硝酸盐乳酸菌的筛选及其在菜用枸杞浆水发酵中的应用

赵海霞，吴 丹，王晓蕾，王艺璋

（1.银川能源学院 化学与生物工程学院，宁夏 银川 750100；2.北方民族大学 生物科学与工程学院，宁夏 银川 750021；3.宁夏回族自治区农村能源工作站，宁夏 银川 750001）

菜用枸杞是茄科（Solanaceae）枸杞属（Lyciun）植物枸杞（Lycium barbarumL.）的嫩茎叶，俗称天精草、地仙苗，是富含黄酮、生物碱、萜类化合物和维生素等多种营养成分[1]的健康蔬菜。在西北，菜用枸杞作为蔬菜的食用方式，主要是焯水后凉拌。由于烹饪方式较单一，大量菜用枸杞无法短期内食用而造成浪费。

浆水是分布在我国西北地区的一种传统发酵蔬菜食品，一般是将新鲜的蔬菜焯水后加入面汤，再加入老浆水作为“引子”，经多种微生物协同发酵而成[2]。因其制作工艺简单，风味独特，营养丰富，深受西北人民青睐[3]。浆水多为家庭自制，品质参差不齐，在发酵过程中亚硝酸盐的存在限制了浆水的发展，对浆水中亚硝酸盐的研究主要集中在变化规律和工艺发酵条件控制方面[4-5]。有关浆水中微生物组成的研究发现，乳酸菌作为浆水发酵过程中的优势菌群之一，以乳酸菌为接入菌种，不仅具有降解亚硝酸盐的作用，同时能形成浆水的独特风味[6]。近年来，从柳州酸笋[7]、泡菜[8-9]、剁辣椒[10]等发酵蔬菜和发酵乳品[11]中筛选出能降解亚硝酸盐的乳酸菌，但对浆水中可降解亚硝酸盐乳酸菌的研究并不多见。

从适合浆水发酵的优势菌中筛选出高效降解亚硝酸盐的乳酸菌作为浆水发酵菌种，将菜用枸杞这种地源性蔬菜根据当地饮食习惯发酵制成浆水，既能丰富浆水专用功能性发酵菌种资源，还可以利用大量菜用枸杞资源开发新的安全健康的浆水产品。因此，本研究通过盐酸萘乙二铵法从源自甘肃天水、定西和通渭等地农家自制浆水中，筛选出高效降解亚硝酸盐的菌株，然后以菜用枸杞为原料进行浆水发酵。通过评价菜用枸杞浆水的风味、口感、色泽，测定亚硝酸盐含量、pH值、总酸，以及分析菜用枸杞发酵前后多糖、甜菜碱和总黄酮含量的变化，以期能够获得既能高效降解亚硝酸盐，又能适用菜用枸杞浆水发酵的专用乳酸菌菌株。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品采集

浆水：从甘肃天水、定西、通渭等地采集农家自制的浆水样品9份，无菌离心管采样，低温带回实验室。菜用枸杞：采自宁夏银川市西夏区地质局农场宁杞1号。商品浆水引子：购自新百超市汉中略阳宁强浆水引子（宁强引子）。

1.1.2 培养基

MRS液体培养基[11]：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，牛肉膏10 g，硫酸镁0.1 g，磷酸氢二钾2 g，柠檬酸二铵2 g，硫酸锰0.05 g，乙酸钠5 g，吐温80 1 mL，蒸馏水定容至1 L，调节pH值6.2～6.4。115 ℃高压蒸汽灭菌20 min。固体培养基中添加琼脂1.5%。

MRS-CaCO3固体培养基：MRS固体培养基中添加碳酸钙1%。

1.1.3 试剂

对氨基苯磺酸、乙酸锌、牛肉浸粉、葡萄糖、吐温80、亚硝酸钠、盐酸萘乙二胺、盐酸、硼砂（均为分析纯）：山东英朗化工有限公司；蛋白胨、酵母粉（均为分析纯）：北京奥博星生物科技有限公司；磷酸二氢钠、柠檬酸二铵、氢氧化钠、MgSO4·7H2O、乙酸钠、K2HPO4·3H2O、亚铁氰化钾、MnSO4·H2O（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；细菌脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒、TaqMaster Mix：北京康为世纪生物科技有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2J型双人型超净工作台：苏州净化设备有限公司；UV1000紫外分光光度计：美国赛默飞世尔科技公司；LDZX-50KBS型压力蒸汽灭菌器：山东博科生物产业有限公司；SD303-4A型数显电热恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；FA2204B电子天平：宁波三丰计量仪器有限公司；XGQ-200型电热鼓风干燥箱：上海泸越仪器责任有限公司；HH-2水浴锅：国华电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 浆水中乳酸菌的分离纯化

取浆水样品1 mL，采用生理盐水按10倍系列梯度稀释至10-7。分别吸取稀释度为10-4、10-5、10-6、10-7的菌悬液100 μL注入培养皿，然后倒入15～20 mL 50 ℃左右的MRS-CaCO3固体培养基，混匀，冷却凝固后于37 ℃恒温培养24 h。根据菌落大小、形状、颜色及钙溶圈大小挑取单菌落，在MRS固体培养基上反复划线纯化2～3次、镜检，得到纯菌落。对所有分离纯化的菌株进行革兰氏染色和过氧化氢酶试验，若革兰氏染色呈阳性，过氧化氢酶接触试验呈阴性，可初步确定为乳酸菌。将纯化后的疑似乳酸菌菌株接种于MRS液体培养基连续传代2次后，甘油管保藏冻存于-80 ℃冰箱。

1.3.2 乳酸菌菌株的分子生物学鉴定

采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取疑似乳酸菌的基因组DNA，以其为模板，参考刘建利等[12]方法PCR扩增16S rDNA基因序列，委托南京金斯瑞生物公司进行测序。将测序序列提交至美国国家生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank数据库中，采用基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）进行同源性比对，从而对菌株进行菌种鉴定。

1.3.3 乳酸菌菌株降解亚硝酸盐能力的测定

将-80 ℃保存的乳酸菌菌种室温融化后，接种于MRS液体培养基，37 ℃培养24 h，连续活化3次。以2%（V/V）的接种量，将活化后的菌液接种于25 mL含125 μg/mL亚硝酸钠的MRS液体培养基中，对照组接种2%无菌水，37 ℃培养72 h，每个试验重复3次，测定培养液中亚硝酸钠的含量，并计算各菌株的亚硝酸盐降解率，其计算公式如下：

1.3.4 菜用枸杞浆水的发酵[13]

新鲜菜用枸杞→洗净→切段→热烫→加面汤→入坛→接种→浆水发酵

操作要点：称量150 g新鲜菜用枸杞，将其冲洗干净后切成4～5 cm的小段，用沸水热烫3 min，22.5 g面粉中加入727.5 mL饮用水，混匀后煮沸制成面汤，将热烫后的菜用枸杞与面汤按质量比1∶1混匀，装入坛子中。按5%的接种量分别接入具有高效亚硝酸盐降解能力的乳酸菌，同时设置对照（接入5%的无菌蒸馏水和接入5%宁强引子），30 ℃下恒温发酵5 d。发酵结束后，测定浆水中的亚硝酸盐含量、酸度及pH值。

1.3.5 菜用枸杞浆水的感官评价

参考侯智勇等[14]方法，随机选10名无不良嗜好同学依据感官评价标准，从色泽、风味及口感方面对菜用枸杞浆水进行感官评定，满分100分，具体评价标准见表1。

表1 菜用枸杞浆水感官评价标准Table 1 Sensory evaluation standard of Lycium barbarum Jiangshui

1.3.6 菜用枸杞浆水理化指标的测定

采用GB/T 5009.33—2016《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中盐酸萘乙二铵法测定亚硝酸盐含量。按照GB/T 12456—2021《食品中总酸的测定》测定总酸含量，以乳酸计。新鲜菜用枸杞与发酵后的枸杞菜65 ℃烘干至恒质量，粉碎后，40目过筛；采用苯酚-硫酸法[15]测定多糖含量，采用薄层扫描法[16]测定甜菜碱含量，采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法[17]测定总黄酮含量。

1.3.7 数据处理与分析

实验重复3次，采用ExceL2010整理数据，采用SPSS22.0进行方差分析，采用Origin8.5软件绘图。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离纯化及鉴定

从不同地区来源的9份浆水样品中共分离纯化出35株乳酸菌，菌落特征均呈白色或乳白色，表面光滑，圆形隆起，边缘整齐，菌落直径在1～3 mm。细胞形态及部分生理生化实验结果见表2。

由表2可知，35株菌株革兰氏染色结果均呈阳性（G+），细胞呈杆状或长杆状，无芽孢，过氧化氢酶试验结果均呈阴性，初步鉴定这35株菌为乳酸菌。进一步采用分子生物学技术对35株菌株进行鉴定，提取其基因组DNA，对其16S rDNA基因序列进行PCR扩增，测序后，测序结果在NCBI中进行BLAST同源性序列比对，结果见表3。

表2 不同来源乳酸菌细胞形态及生理生化特征Table 2 Cell morphology and physiological and biochemical characteristics of lactic acid bacteria from different sources

表3 35株乳酸菌菌株16S rDNA基因序列的比对及鉴定结果Table 3 Comparison and identification results of 16S rDNA sequences of 35 strains of lactic acid bacteria

续表

续表

由表3可知，35株乳酸菌被鉴定为3个不同的属，其中29株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），占82.86%，由此看出，9份浆水样品中分离出的乳酸菌中植物乳杆菌占比最高，为优势菌。此外，3株乳酸菌被鉴定为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei），3株乳酸菌被鉴定为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）。

2.2 降解亚硝酸盐乳酸菌的筛选

2.2.1 亚硝酸盐降解率及pH值的测定

35株乳酸菌菌株的亚硝酸盐降解能力及发酵液的pH值见表4。

由表4可知，35株乳酸菌均具有亚硝酸盐降解能力，其中4株乳酸菌的亚硝酸盐降解能力较弱，降解率＜60%，其中，菌株通渭A8的亚硝酸盐降解率最低，为21.33%；6株乳酸菌的亚硝酸盐降解率为60%～70%，占总数的17.1%；7株乳酸菌的亚硝酸盐降解率为70%～80%，占总数的20%；13株乳酸菌的亚硝酸盐降解率为80%～90%，占总数的37.1%；5株乳酸菌的亚硝酸盐降解率＞90%，占总数的14.3%，其中，菌株通渭A7的亚硝酸盐降解率最高，为93.81%，菌株天水A14的亚硝酸盐降解率次之，为93.51%，菌株平凉4的亚硝酸盐降解率为93.40%，菌株武都A1的亚硝酸盐降解率为91.85%，菌株定西4的亚硝酸盐降解率为91.83%，故选择亚硝酸盐降解率高的这5株乳酸菌进行菜用枸杞浆水的发酵。

表4 35株乳酸菌菌株的亚硝酸盐降解率及发酵液的pH值Table 4 Nitrite degradation rate and pH of fermentation broth of 35 strains of lactic acid bacteria

空白培养基的pH值为6.43，接种乳酸菌后培养液pH明显下降，但这35株乳酸菌接种72 h后培养液pH值波动范围不大，其范围为3.91～4.07，pH均接近4左右，能在发酵过程中提供较好的酸性环境，抑制杂菌的生长，增加了这些菌株运用于浆水发酵的可能性。

乳酸菌作为浆水发酵过程中的优势菌[18]，具有降胆固醇[19]、降尿酸[20]、抑菌性[21]等功能，可发酵产酸、细菌素等多种抑菌物质，能够抑制和杀死发酵食品中的腐败菌和致病菌[22]。本研究分离得到的乳酸菌不仅能迅速降低浆水的pH值，还能降解亚硝酸盐，说明浆水中蕴藏着丰富而独特的微生物资源，有待进一步挖掘。

2.3 可降解亚硝酸盐乳酸菌菌株应用于菜用枸杞发酵浆水的潜力评估

2.3.1 菜用枸杞浆水的感官评价

5株乳酸菌发酵菜用枸杞浆水的感官评价结果见图1。由图1可知，对照组菜用枸杞浆水的色泽、风味、口感分值最低，浆水有明显臭味，酸败严重并且表面白膜严重，而菌株天水A14发酵的浆水综合评分最高，宁强引子次之。除对照组外，在口感方面，菌株通渭A7和武都A1发酵的浆水在口感上差异性不大，其他3株乳酸菌发酵的浆水在口感上差异性较大，接种菌株天水A14发酵的浆水口感最好，浆水菜有一定的脆度，分值最高，评分为41.67分。添加宁强引子发酵的浆水味道醇厚，可能是因为添加的宁强引子中含有酵母菌，混菌发酵的缘故。菌株定西4发酵的浆水口感评分最差，其分值为27.77分。在风味方面，接种菌株天水A14和平凉4发酵的浆水风味最佳，酸香味浓郁且具有菜用枸杞的清香味，菌株定西4发酵的浆水风味最差，分值为16.03分。在色泽方面，宁强引子发酵的浆水呈嫩黄色，半透明且有光泽。接种菌株天水A14和通渭A7发酵的浆水为嫩黄色，有色泽，浆水清澈。菌株定西4发酵的浆水色泽最差，感官评分为12.63分。经过综合评价后，菌株天水A14发酵的菜用枸杞浆水的感官评分最高，为91.67分，菌株定西4发酵的菜用枸杞浆水的感官评分最差，为56.43分，说明菌株天水A14更适用于菜用枸杞浆水的发酵。

图1 各菌株发酵菜用枸杞浆水感官评价结果Fig.1 Sensory evaluation results of Lycium barbarum Jiangshui fermented by different strains

2.3.2 菜用枸杞浆水中亚硝酸盐含量的测定

菜用枸杞浆水发酵结束后，测定亚硝酸盐含量，结果见图2。由图2可知，5株乳酸菌均能显著降解亚硝酸盐含量（P＜0.05）。对照组中亚硝酸盐含量最高，为10.43 mg/kg，高于地方标准DB51/T975—2009《四川泡菜》中对亚硝酸盐限量为10 mg/kg的标准。菌株平凉4发酵的浆水亚硝酸盐含量最低，为0.56 mg/kg，而菌株定西4发酵的浆水中亚硝酸盐含量高于宁强引子发酵的浆水，其亚硝酸盐含量为4.12 mg/kg，高于农业行业标准NY/T 437—2012《绿色食品酱腌菜》中对亚硝酸盐的限量为4 mg/kg的标准。菌株通渭A7、天水A14、武都A1和平凉4发酵的浆水中亚硝酸盐含量均低于宁强引子发酵的浆水，且亚硝酸盐含量均在其限定安全范围内，表明这4株乳酸菌在菜用枸杞浆水发酵过程中同样具有降解亚硝酸盐的能力。

图2 各菌株发酵菜用枸杞浆水中亚硝酸盐含量的测定结果Fig.2 Nitrite content determination results of Lycium barbarum Jiangshui fermented by different strains

2.3.3 菜用枸杞浆水中总酸含量的测定

乳酸菌在厌氧条件下利用糖类产生乳酸，提高浆水中的总酸含量[4]，各菌株发酵菜用枸杞浆水中的总酸含量见图3。由图3可知，菌株天水A14发酵浆水的总酸含量最高，为0.28%，宁强引子发酵浆水的总酸含量最低，为0.16%。5株乳酸菌发酵的浆水的总酸含量均显著高于宁强引子发酵的浆水，说明可降解亚硝酸盐的乳酸菌在浆水发酵过程中的产酸能力较强。

图3 各菌株发酵菜用枸杞浆水中总酸含量的测定结果Fig.3 Total acid content determination results of Lycium barbarum Jiangshui fermented by different strains

2.3.4 菜用枸杞浆水pH值的测定

各菌株发酵菜用枸杞浆水的pH值见图4。由图4可知，宁强引子发酵浆水的pH值最高，为4.18，而菌株武都A1发酵浆水的pH值最低，为3.68。5株菌株发酵浆水的pH值在3.68～3.86之间，各菌株在发酵过程没有产酸能力特别突出的菌株，但能给浆水提供有利的酸性环境，有利于乳酸菌的生长。乳酸菌接种发酵后，浆水的pH值都比MRS液体培养基中pH值低，其原因可能是菜用枸杞浆水发酵时间比MRS液体培养基中的时间长，但与宁强引子发酵的浆水相比，筛选出的菌株发酵的浆水的pH值更低。

图4 各菌株发酵菜用枸杞浆水的pH值Fig.4 The pH of Lycium barbarum Jiangshui fermented by different strains

此外，在浆水发酵过程中，低pH值有利于亚硝酸盐的降解[4]。亚硝酸盐的降解与酸性环境有关[5]，在发酵的前期，浆水中有其他菌种的参与，pH值较高，浆水中酸性物质含量少，浆水中的亚硝酸盐含量增加，即浆水中的pH值趋向硝酸还原酶的最适pH时，硝酸还原酶活性和亚硝酸盐含量均呈上升趋势；在发酵中期，pH降低，乳酸菌成为优势菌群，浆水中酸性物质增加，使得亚硝酸盐含量下降。

2.3.5 菜用枸杞发酵前后活性成分含量的变化

菜用枸杞富含多糖、甜菜碱和黄酮类营养成分，测定菜用枸杞发酵前后这些功能性营养成分含量，判断菜用枸杞浆水的营养功效，结果见图5。因接种菌株定西4的菜用枸杞浆水的亚硝酸盐含量超标，且感官评分较低，没有可开发价值，故未进行多糖、甜菜碱和总黄酮含量测定。

图5 菜用枸杞发酵前后多糖（a）、甜菜碱（b）及总黄酮（c）含量的变化Fig.5 Changes in polysaccharide (a),lycine (b) and total flavone (c) content before and after the fermentation of Lycium barbarum

由图5a可知，菜用枸杞鲜样的多糖含量为25.74 mg/g，接种发酵后，多糖含量呈现不同的变化趋势。菌株通渭A7、天水A14发酵菜用枸杞中的多糖含量较鲜样有少量的增加，接种宁强引子、菌株平凉4和武都A1发酵后的菜用枸杞中多糖含量较鲜样有所降低，且菌株平凉4发酵后的菜用枸杞呈显著水平（P＜0.05）。菌株通渭A7和天水A14发酵的菜用枸杞中多糖含量显著高于宁强引子发酵的菜用枸杞（P＞0.05）。多糖含量升高的原因可能是菌株通渭A7、天水A14属于产胞外多糖乳酸菌，在发酵过程中能产生多糖导致多糖含量上升，赵婧等[23-24]也有相似的研究报道。

由图5b可知，菜用枸杞鲜样中的甜菜碱含量为5.31mg/g，接种4株乳酸菌及宁强引子发酵后菜用枸杞后，甜菜碱含量均降低，且接种菌株武都A1发酵后的菜用枸杞甜菜碱含量（4.48 mg/g）下降显著（P＜0.05），分析原因可能是菜用枸杞在浆水发酵前经过沸水热煮处理造成的甜菜碱损失。

由图5c可知，菜用枸杞鲜样中总黄酮的含量为0.80mg/g，接种菌株武都A1发酵后的菜用枸杞总黄酮含量（0.67 mg/g）较鲜样显著降低（P＜0.05）。接种通渭A7、平凉4发酵的菜用枸杞中总黄酮含量较鲜样仅有少量的减少，无显著性差异（P＜0.05）。接种菌株天水A14发酵的菜用枸杞中总黄酮的含量显著高于鲜样中总黄酮含量（P＜0.05），分析原因可能是由于菌株天水A14在发酵过程中分泌的代谢物作用于前体物质转化为黄酮类物质造成的，这与黄玉军等[25-26]的研究结果相似。

3 结论

本试验从9份不同来源的浆水中分离得到35株乳酸菌，经鉴定，29株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），3株为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei），3株为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）。复筛得出5株具有高效降解亚硝酸盐能力的乳酸菌，亚硝酸盐降解率＞90%，将其应用于菜用枸杞浆水发酵，结果发现，接种菌株天水A14发酵的菜用枸杞浆水外观澄清半透明、风味突出、有浓郁的菜用枸杞香味，酸度适中，感官综合评分最高（91.67分），浆水中亚硝酸盐含量为1.74 mg/kg，总酸含量为0.28%，pH值为3.69。对发酵前后菜用枸杞中活性成分进行测定，结果发现，接种菌株天水A14发酵浆水菜中多糖含量为26.92 mg/g，总黄酮含量0.92 mg/g，较发酵前鲜样含量增加。综上，菌株天水A14为优良菌株，其既能高效降解亚硝酸盐，同时发酵的菜用枸杞浆水品质优良，可作为浆水发酵功能性菌株的候选菌株。