不同等级高温大曲微生物群落和代谢物的特征分析

丁 芳，张原頔，蒋英丽，陈 波，陈小雪，3 *，韩北忠

（1.中国农业大学 食品科学与营养工程学院 食品质量与安全北京实验室，北京 100083；2.四川郎酒股份有限公司，四川 泸州 510500；3.中国农业大学营养与健康系，北京 100083）

大曲作为白酒的糖化发酵剂，对白酒的质量有重要影响，其品质的稳定性受到白酒生产企业的高度重视[1]。大曲微生物主要包括霉菌、酵母菌、细菌和放线菌，这些微生物主要来自原料和生产环境，通过复杂的代谢活动分解原料，产生丰富的白酒风味前体物质和其他代谢物[2]。高温大曲是以小麦为制曲原料，经过高温培菌发酵，贮存三个月以上的糖化发酵剂，对酱香型白酒风味和品质的影响尤为重要[3]。在实际生产过程中，大曲质量评价和等级划分很大程度上依赖于感官评价和简单的理化指标检测，感官评价指标主要包括外观、断面和香气等，它具有方便和快速等特点[4-5]，理化指标主要包括水分、酸度、糖化力和液化力等。然而，由于感官评价的主观性和局限性难以满足大曲品质标准化生产的需求，因此根据感官全面探讨不同等级高温大曲微生物群落和代谢物组成的差异，有助于建立科学的大曲质量评价标准。

随着现代分子生物学技术的发展，高通量测序技术（high-throughput sequencing，HTS）能够深入解析高温大曲的微生物群落结构。郑亚伦等[6]采用高通量测序技术发现数字化高温大曲和传统高温大曲在发酵过程中微生物群落结构具有显著变化，发酵结束时，两种高温大曲的细菌群落均以克罗彭斯特菌属（Kroppenstedtia）占绝对优势，真菌群落以嗜热子囊菌属（Thermoascus）和嗜热真菌属（Thermomyces）为优势菌属。杨少勇等[7]采用高通量测序技术发现高温大曲真菌群落以嗜热真菌属（Thermomyces）和嗜热子囊菌属（Thermoascus）为主，而中高温大曲真菌群落以嗜热真菌属（Thermomyces）、嗜热子囊菌属（Thermoascus）和曲霉菌属（Aspergillus）为主。气相色谱-离子迁移谱（gas chromatography-ion mobility spectroscopy，GC-IMS）结合了气相色谱高分离度和离子迁移谱高灵敏度的优势，无需任何特殊的样品前处理，即可快速检测大曲样品中的挥发性代谢物[8]。ZHANG Y D等[9]通过GC-IMS检测了新鲜大曲和成熟大曲中挥发性有机化合物组成，结果表明熟化前后高温大曲中挥发性有机化合物存在显著差异。此外，采用核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）对大曲样品进行1H NMR代谢物谱分析发现，大曲样品主要为非挥发性代谢物[10]。HU Y N等[11]通过核磁共振技术对三种清香型大曲进行了1H NMR代谢物谱分析，结果表明，乙醇、葡萄糖、脯氨酸、乳酸、阿拉伯糖醇、赤藓糖醇、甘油、乙酸和甜菜碱是三种大曲中丰富的代谢物。

本研究通过比较不同等级高温大曲微生物群落组成、挥发性和非挥发性代谢物组成及含量的差异，并结合理化指标检测结果，综合分析不同等级高温大曲的品质特征，该研究一定程度上为高温大曲质量评价标准体系的建立提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高温大曲样品：高温大曲熟化6个月，取自四川省某酒厂制曲车间，该批大曲的生产采用相同的原料和工艺；E.Z.N.A.soil 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Kit试剂盒：美国Omega公司；2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮和2-壬酮（均为分析纯）：国药集团化学试剂（北京）有限公司；斐林试剂（分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；福林酚（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；碘化钾（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；三氯乙酸（分析纯）：合肥天健化工有限公司。

1.2 仪器与设备

1.3 方法

1.3.1 高温大曲样品的感官评价及采集

感官评价小组由10名经验丰富的专业感官评判师组成，对熟化6个月的大曲从外观、香气和断面等方面进行感官评价[5]。从不同等级大曲样品中随机抽取各6块，粉碎混合好后置于无菌袋中，密封，样品保存在-80 ℃，备用。

1.3.2 高温大曲的理化指标检测

水分、酸度、pH、糖化力和液化力测定：参考唐佳代等[12]的方法。中性蛋白酶活力的测定：参考ZHANG Y D等[9]的实验方法。中性蛋白酶活力单位的定义：在温度为40 ℃，pH7.0条件下，每分钟从酪蛋白中水解产生1 μg酪氨酸所需的酶量为一个酶活力单位。

1.3.3 高温大曲的DNA提取、PCR扩增及高通量测序

1.3.4 高温大曲的挥发性化合物检测

采用GC-IMS对高温大曲的挥发性有机化合物进行分析。称取1.000 g大曲粉末，置于20 mL顶空玻璃采样瓶中，于60 ℃孵育15 min后进样100 μL。

自动顶空进样器条件：顶空孵育温度为60 ℃；孵育时间为15 min；不分流进样；顶空进样体积为100 μL；进样针温度为85 ℃；加热方式为振动加热；振动速度为500 r/min。

气相色谱条件：色谱柱为WAX毛细管柱（30m×0.53mm，1 μm）；柱温为60 ℃；载气为高纯氮气（N2）；载气流速为初始流速2 mL/min保持2 min、2～10 min线性增加至10 mL/min、10～20 min 线 性增加至100 mL/min，20～30 min 保持100 mL/min。

离子迁移谱条件：迁移管长度为9.8 mm；管内线性电压为500 V/cm；迁移管温度为45 ℃；漂移气为N2；放射源为β射线（氚，3H）；电离模式为正离子。

定性定量分析：通过对比标准信息库美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）和IMS数据库对挥发性化合物进行定性分析并根据峰强度进行挥发性化合物定量。

1.3.5 高温大曲非挥发性化合物检测

高温大曲非挥发性化合物检测采用Avance III600-MHz NMR光谱仪进行测定。准确称取0.300 g大曲粉末于2 mL离心管中，加入1.5 mL冷却的超纯水，研磨60 s，放在冰上冷却10 min后，以13 000 r/min的转速在4 ℃下离心10 min。取上清液1.0 mL于新的离心管中，加入1.0 mL重水磷酸盐缓冲液，继续以13 000 r/min的转速在4 ℃下离心10 min，取适量上清液于5 mm内径的核磁管中待测。1H NMR检测条件和数据分析参考HU Y N等[11]的方法。

1.3.6 数据统计分析

采用QIIME2和R v3.2.0进行微生物组生物信息学分析，测序结果基于DADA2算法得到的扩增子序列变异体（amplicon sequence variants，ASV）进行划分，分析其微生物群落多样性及组成。利用SIMCA 14.1对代谢物数据进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法-判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）。使用IBM SPSS Statistics 26.0进行单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）和Duncan检验计算样品间的显著性（P＜0.05）。图表的整理和绘制采用TBtools软件。

2 结果与分析

2.1 高温大曲样品的感官评价

根据感官评价结果将高温大曲样品分为一级大曲（OJ）、优级大曲（YJ）和特级大曲（TJ），其感官特征见表1。

表1 不同等级高温大曲的感官特征Table 1 Sensory characteristics of high-temperature Daqu with different grades

2.2 高温大曲的理化特性分析

大曲的质量与其理化特性密切相关[13]。高温大曲OJ、YJ和TJ的理化指标见图1。由图1A可知，水分含量由高到低的大曲分别为OJ、YJ、TJ，其中OJ的水分含量（13.2%）显著高于大曲YJ和TJ（P＜0.05）。白酒酿造所用成熟大曲的水分含量一般不宜超过13%[14]。水分含量过高会导致大曲再次生霉，不利于大曲的质量。由图1B可知，大曲OJ的pH值（6.45）显著高于大曲YJ和TJ（P＜0.05）。由图1C可知，大曲OJ的酸度（0.85 mmol/10 g）显著低于大曲YJ和TJ（P＜0.05）。适当的酸度可一定程度上抑制杂菌生长，还可为有益微生物提供适宜的生存条件。大曲的酸度主要与产酸微生物的有机酸代谢及淀粉、蛋白质和脂肪等的降解有关[13]，而酱香型大曲的酸度范围为（1.0～3.5）mmol/10 g[14]。

图1 不同等级高温大曲的理化特性比较Fig.1 Comparison of physicochemical properties of high-temperature Daqu with different grades

大曲中有丰富的淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶等水解酶，复杂的水解酶是淀粉和蛋白质等大分子物质降解的驱动力，为微生物的代谢提供物质基础[15]。由图1D可知，大曲OJ的糖化力（289 mg/（g·h））高于YJ和TJ，且与TJ差异显著（P＜0.05）。由图1E可知，大曲OJ的液化力（1.6 g/（g·h））显著高于YJ和TJ。由图1F可知，大曲OJ的蛋白酶活力最低，与YJ和TJ均存在显著差异（P＜0.05）。这些水解酶活性的不同，与三种高温大曲不同的微生物群落组成有着直接的关联性[16]。

2.3 高温大曲的α-多样性分析结果

Shannon指数代表微生物群落多样性，Chao1指数常用来估计微生物群落丰富度，Good's coverage指数接近1.00表明测序深度足以代表所研究的微生物群落[17]。3个高温大曲细菌和真菌群落的α-多样性指数见表2。由表2可知，对于Shannon指数、Chao1指数和Good's coverage指数。所有高温大曲样品的细菌群落多样性和丰富度均高于真菌群落，这与之前的研究一致[18]。与高温大曲OJ和YJ相比，TJ的细菌表现出更高的微生物群落丰富度和多样性，其细菌Shannon指数、Chao1指数和Good's coverage指数分别为5.366 13、66、0.999 9，真菌的Shannon指数、Chao1指数和Good's coverage指数分别为2.250 15、35、0.999 9。

表2 不同等级高温大曲微生物群落的α-多样性指数比较Table 2 Comparison of alpha diversity indexes of high-temperature Daqu with different grades

2.4 高温大曲中微生物群落组成特征的比较

不同等级高温大曲在扩增子序列变异体（ASV）水平上的细菌和真菌群落比较见图2。

图2 不同等级高温大曲在扩增子序列变异体水平上的细菌和真菌群落比较Fig.2 Comparison of bacterial and fungal community of high-temperature Daqu with different grades at amplicon sequence variants level

由图2a可知，3个等级高温大曲共检测到121个细菌ASV，其中大曲OJ、YJ和TJ的细菌ASV分别有46、66和66个，三者共有21个细菌ASV，分别属于3个门和4个属。由图2b可知，3个等级高温大曲共检测到48个真菌ASV，ASV数量以大曲TJ最多（35个），大曲YJ次之（12个），大曲OJ最少（10个），三者共有4个ASV，分别属于1个门和三个属。这与α-多样性指数的结果一致（表2）。进一步将3个等级高温大曲中共有细菌和真菌ASV丰度归一化后进行比较，由图2c和图2d可知，慢生芽孢杆菌属（Lentibacillus）和嗜热子囊菌属（Thermoascus）在大曲OJ中占优势，踝节菌属（Ralstonia）和糖多孢菌属（Saccharopolyspora）在大曲YJ中占优势，而克罗彭斯特菌属（Kroppenstedtia）和曲霉菌属（Aspergillus）在大曲TJ中更占优势。

不同等级高温大曲在属水平上细菌和真菌群落相对丰度的比较见图3。所有样品在细菌属水平上共24个物种，由图3a可知，慢生芽孢杆菌属（Lentibacillus）和克罗彭斯特菌属（Kroppenstedtia）在3个等级高温大曲中的相对丰度均＞20%，这也与其他学者对高温大曲微生物群落的研究一致[19]。其中大曲OJ以慢生芽孢杆菌属（Lentibacillus）（44.61%）、克罗彭斯特菌属（Kroppenstedtia）（28.24%）、葡萄球菌属（Staphylococcus）（24.16%）和枝芽孢杆菌属（Virgibacillus）（1.56%）为主。与大曲OJ相比，大曲YJ中克罗彭斯特菌属（Kroppenstedtia）（24.57%）、慢生芽孢杆菌属（Lentibacillus）（22.27%）和葡萄球菌属（Staphylococcus）（0.75%）的相对丰度下降，而芽孢杆菌属（Bacillus）（41.74%）和糖多孢菌属（Saccharopolyspora）（1.23%）的相对丰度增加。大曲TJ中高相对丰度细菌属组成如芽孢杆菌属（Bacillus）（44.89%）、克罗彭斯特菌属（Kroppenstedtia）（28.86%）、慢生芽孢杆菌属（Lentibacillus）（24.49%）与大曲YJ的微生物群落结构更为相似。

图3 不同等级高温大曲在属水平上细菌（a）和真菌群落（b）相对丰度的比较Fig.3 Comparison of relative abundance of bacterial (a) and fungal community (b) at genus level in high-temperature Daqu with different grades

克罗彭斯特菌属（Kroppenstedtia）是高温放线菌科的主要属，能在大曲高温高湿的环境下生长旺盛，适当的高温和湿度有助于大曲中适度的美拉德反应，影响着大曲的质量。许多研究发现，该属在各种大曲微生物群落中占优势，但其在大曲生产中的作用尚不明确，需要进一步研究[8]。慢生芽孢杆菌属（Lentibacillus）是酱香型白酒生产中重要的微生物菌群[19]。宏蛋白质组学数据表明，该属能分泌多种蛋白酶，是具有强氨基酸代谢功能的优势降解菌[20]。芽孢杆菌属（Bacillus）是成熟大曲中常见的一种耐热微生物，可分泌蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等多种水解酶，是大曲重要的功能微生物[17，21-22]。此外，芽孢杆菌菌种的强化接种不仅能改变微生物群落结构，调节其代谢活动，还能改善大曲的风味特征[23]。葡萄球菌属（Staphylococcus）可能从环境带入到大曲生产中[2]。HU Y N等[11]比较了三种清香型大曲的微生物群落和代谢物特征，研究发现芽孢杆菌属（Bacillus）和葡萄球菌属（Staphylococcus）呈现显著负相关。

由图3b可知，曲霉属（Aspergillus）在大曲OJ和TJ中占主导地位（相对丰度分别为66.67%和70.74%），曲霉是大曲中常见的优势霉菌，能够产生白酒固态酿造所需的多种酶[19]，而在大曲YJ中的相对丰度较低（16.60%）。大曲OJ中嗜热子囊菌属（Thermoascus）的相对丰度（21.46%）远高于YJ和TJ（相对丰度分别为8.96%和1.38%）。踝节菌属（Rasamsonia）仅在大曲YJ中占绝对优势（43.42%），该属在纤维素降解和发酵中起着重要作用[24]。此外，丝衣霉属（Byssochlamys）在大曲TJ中（1.04%）相对丰度更高。在DENG L等[3]的研究中，丝衣霉属为黄色高温大曲的优势属，能够降解原料中的淀粉和纤维素。曲霉属（Aspergillus）可产生广泛的胞外酶，用于淀粉糖化、蛋白质水解等，在发酵过程中形成各种风味化合物[24-26]。嗜热子囊菌属（Thermoascus）能产生大量耐热酶，有效地降解碳水化合物[21]。糖化力和液化力是评价大曲品质的重要指标[27]。酱香型大曲的糖化力较清香型和浓香型大曲低，出仓曲糖化力一般在300 mg/（g·h）以下[28]。与大曲YJ和TJ相比，大曲OJ中较高的糖化力和液化力可能与样品中曲霉属和嗜热子囊菌属的较高相对丰度有关。结果表明，3个等级高温大曲中优势微生物种类和相对丰度均存在一定差异。由于大曲中微生物相互作用和酶系的复杂性，会产生不同的代谢产物，因此大曲OJ、YJ和TJ的代谢产物特征有待进一步研究。

2.5 高温大曲中挥发性代谢物的比较

通过HS-GC-IMS测定了不同等级高温大曲中挥发性化合物组成及含量，其结果见图4。由图4a可知，多个信号识别为一个化合物，是由于这些化合物通过漂移区时在离子和中性分子之间形成二聚体，包括乙酸、乙酸乙酯、1-丙醇、丁醛、2-甲基丁醛、丁醇、2-丁酮、3-甲基-1-丁醇、2-甲基丙醇、丙醛、乙醇、3-甲基-丁醛。指纹图谱中每一行代表一个样品中选取的全部信号峰，每一列代表同一个挥发性化合物在所有样品中的信号峰。由图4b可知，3种高温大曲的挥发性代谢物种类和浓度存在明显差异。图中区域A物质（2-甲基丙醇单体、2-甲基丙醇二聚体、3-甲基-1-丁醇单体、3-甲基-1-丁醇二聚体、2-丁酮单体、2-丁酮二聚体、丁醇单体和丁醇二聚体等醇类物质）在大曲OJ样品中的含量较高。区域B物质（2-甲基丁醛单体、2-甲基丁醛二聚体、丁醛单体、丁醛二聚体、1-丙醇单体、1-丙醇二聚体和2,3丁二酮）的含量在大曲YJ和TJ样品中分布相似。因此，大曲OJ中醇类物质的含量较高，而大曲YJ和TJ中醛酮类物质的含量更高。区域C的物质（乙酸单体、乙酸二聚体、乙酸乙酯单体和乙酸乙酯二聚体）仅在大曲TJ中更为丰富。大曲风味化合物的形成是多种代谢反应的结果，在很大程度上受到复杂微生物群落的影响。

基于GC-IMS数据进行了PCA，结果见图4c。由图4c可知，大曲OJ、YJ和TJ组间样本分离明显，这表明不同等级高温大曲中挥发性化合物组成和含量存在显著差异。前两个主成分解释了总方差的84.6%，PC1和PC2的值分别为71.4%和13.2%。相比之下，大曲YJ和TJ中的挥发性化合物组成较为相似，两者的差异主要体现在大曲TJ中乙酸和乙酸乙酯的含量更高。

图4 不同等级高温大曲中挥发性化合物比较Fig.4 Comparison of volatile compounds in high-temperature Daqu with different grades

2-甲基丙醇、3-甲基-1-丁醇和1-丙醇等醇类物质均为大曲和白酒中公认的风味成分，有着甜香、焦香和酒香等风味特征[29-30]。丙醛和丁醛等醛类的气味阈值低，有助于形成发酵食品的独特风味。酯类通常提供着怡人的果香、花香和甜香等气味，已被证明是白酒中十分重要的成分，也可能是影响大曲香气的重要因素[13]。

2.6 高温大曲中非挥发性代谢物的比较

采用氢谱核磁共振技术对大曲样品进行了1H NMR代谢物谱分析，大曲OJ、YJ和TJ中共检出280种非挥发性代谢物，包括糖类、醇类、酸类、多元醇类、氨基酸及其衍生物等。这些代谢物主要是由美拉德反应、酶促反应和微生物代谢等一系列复杂过程产生的[9]。

不同等级高温大曲中非挥发性代谢物分析结果见图5。由图5a可知，通过建立PLS-DA模型对3种高温大曲样品的非挥发性代谢物进行差异分析，结果中R2X（39.6%）和R2Y（21.7%）解释了61.3%的总方差贡献率，其中R2X和R2Y分别表示模型对X和Y的解释度。可以看到3种高温大曲的非挥发性代谢物种类和浓度存在显著差异。

由图5b可知，不同等级高温大曲中重要的差异代谢物共58种（变量重要性投影（variable importance in projection，VIP）＞1）。大曲OJ中的乙醇、木糖醇和乳酸盐含量高于YJ和TJ，大曲YJ中的葡萄糖、果糖、甜菜碱、2-氨基己二酸、醋酸盐、葡萄糖醇、赤藓糖醇和阿拉伯糖醇的含量高于大曲OJ和TJ。石亚林等[31]的研究表明，大曲中的游离态糖和糖醇主要是葡萄糖、甘露醇和核糖醇。大曲TJ中非挥发性代谢物的种类更为丰富、含量更高，尤其是多种氨基酸（包括丝氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胱氨酸、脯氨酸、缬氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、高丝氨酸和丙氨酸）含量高于大曲OJ和YJ。大曲生产过程中，蛋白质被蛋白酶水解为多肽和氨基酸，这与白酒风味物质的形成有密切的联系[15]。曲霉属和芽孢杆菌属是产生淀粉酶和蛋白酶的重要功能微生物[29，32]，大曲TJ中蛋白酶活力和氨基酸含量更高与这2个菌属的代谢活动密切相关。大部分非挥发性代谢物含量在大曲TJ中更高，反映出大曲TJ中的各种代谢活动更为旺盛。葡萄糖、甘露醇、赤藓糖醇、谷氨酸、甘露糖、2-磷酸甘油酸酯、脯氨酸等是3个等级高温大曲中丰富的代谢物，这些代谢物大多被认为是大曲中主要的风味物质及其前体物质[33]。

图5 不同等级高温大曲中非挥发性化合物的偏最小二乘法-判别分析（a）及层次聚类分析热图（b）Fig.5 Partial least squares-discriminant analysis (a) and hierarchical cluster analysis heatmap (b) of non-volatile compounds in high-temperature Daqu with different grades

3 结论

本研究对不同等级高温大曲微生物群落和代谢物的潜在差异进行了比较。微生物测序结果表明，芽孢杆菌属、葡萄球菌属和踝节菌属等是造成大曲OJ、YJ和TJ微生物群落组成差异的重要菌属。挥发性代谢物检测结果表明，3个等级高温大曲的挥发性代谢物组成及含量存在显著差异，体现在醇类、醛酮类和酯类等物质。非挥发性代谢物检测结果表明，3个等级高温大曲中非挥发性代谢物谱存在显著差异，主要体现在氨基酸等物质；此外大曲TJ中的非挥发性代谢物种类更加丰富，含量更高。后续研究应侧重于对不同等级高温大曲中微生物的功能进行研究，以更好地了解微生物群落在大曲中的作用。