小鼠Spata3 蛋白结构和功能的生信分析及初鉴

李美宁,马庆,弓韬,张引红,闫萍,翟翔,郭睿∗

(1.山西医科大学生物化学与分子生物学教研室,出生缺陷与细胞再生山西省重点实验室,太原 030001;2.山西医科大学实验动物中心,实验动物与人类疾病动物模型山西省重点实验室,太原 030001)

哺乳动物精子形成是一个非常复杂特异的过程,包括精子细胞发生的分化与增殖分裂和精子细胞变态成形。精子细胞的特殊形成过程受到多种因素的精细调控,尤其是睾丸组织特异性表达蛋白,深入探究其内在形成过程及参与分子的功能将有利于理解精子发生的分子机制,进而为揭示男性不育的发病机制提供理论和实验支持。精子发生相关蛋白3(spermatogenesis associated protein 3,Spata3),亦称睾丸与生精细胞凋亡相关基因1,是我国学者傅俊江等[1]于2003 年应用小鼠隐睾模型和抑制消减杂交筛选出的新EST 片段,通过巢式PCR首次从小鼠克隆获得,并利用人类cDNA 文库得到人同源基因,因在小鼠隐睾模型的患侧组织中表达较高,推测可能与生精细胞凋亡相关。随后研究者通过基因表达谱芯片分析发现非梗阻性无精症患者Spata3 表达水平比正常男子降低5.58 倍,提出Spata3 可能是无精症的分子诊断标记[2]。近年来国内外的研究表明Spata3 主要位于睾丸组织,基因缺失后精子形态改变,受精能力下降[3],因此Spata3可能与精子发生及变形过程紧密相关。但目前对该基因功能发挥的作用途径有凋亡[1]与自噬[4]两个不同方面的报道,所以有必要利用生物信息学的相关技术系统梳理分析Spata3 基因和蛋白的特征,进而为明确其发挥功能的分子作用机制和途径指引方向。因此,本文利用生物信息学的方法[5],分析预测Spata3 的理化特征、空间构象及相互作用蛋白等,并借助免疫组织化学染色和荧光染色初步验证Spata3 的细胞定位,为下一步研究其在精子发生变形中的作用机制提供线索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

6 只8 周龄SPF 级BALB/c 雄性小鼠,体重20～25 g,由山西医科大学实验动物中心提供【SCXK(晋)2019-0004】,给予灭菌饲料、蒸馏水自由饮食,饲养室温度22～25℃、湿度50%～70%、每12 h 光照/黑暗循环。颈椎脱臼处理后分离睾丸组织,用于免疫组织染色,实验操作在山西医科大学实验动物中心实验室完成【SYXK(晋)2019-0007】。所有操作符合山西医科大学动物实验伦理学要求(SYDL2020006)。

1.1.2 主要试剂与仪器

Anti-Spata3(ProSci,6551),即用型免疫组化试剂盒(博士德,SA1028),Cy3 标记donkey anti-rabbit荧光二抗(Jackson,711-175-152),Pro Long ® Gold Antifade Reagent with DAPI(Invitrogen,P36931),正置光学显微镜(尼康,Nikon Eclipse E100,日本),荧光显微镜(尼康,Ni-U,日本)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠Spata3 序列来源

基因在染色体定位信息、cDNA 及蛋白质序列来源于美国国家生物技术信息中心数据库,基因登录号NC-000067.7。

1.2.2 小鼠Spata3 一般特征分析

分子组成、分子质量、等电点、酸碱性及稳定性等理化性质应用ExPASy 系统的ProtParam tool 软件分析。亲疏水性通过Protscale 软件计算。有无信号肽采用SignalP 6.0 Server 软件在线分析。跨膜区利用TMHMM Server v.2.0 软件预测[6]。

1.2.3 小鼠Spata3 高级结构预测

二级结构使用SOPMA 和GOR 4 软件在线分析[7]。三级结构借助Robetta 软件从头计算建模。蛋白结构域应用Uniprot 网站预测。

1.2.4 小鼠Spata3 蛋白潜在修饰位点分析

磷酸化位点使用NetPhos3.1 软件分析;N-型糖基化位点应用NetNGlyc1.0 分析;O-型糖基化位点采用YinOYang1.2 Server 分析。

1.2.5 小鼠Spata3 蛋白功能预测

基因表达谱和细胞表达模式通过GEO 分析。亚细胞定位和核定位序列借助 PSORT 和NLStradamu 软件预测。分子功能、细胞组分和生物学通路利用NetGO 3.0 软件分析。与小鼠Spata3 互作蛋白通过STRING 数据库预测。

1.2.6 免疫组织化学染色

免疫组织化学染色分析主要参考文献[4]进行。取8 周龄BALB/c 雄性小鼠睾丸组织,4%多聚甲醛固定、常规石蜡包埋、连续切片(厚5 μm)、铺片于载玻片上,烤箱烘干。使用通用型免疫组织化学试剂盒经亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(avidin biotinylated enzyme complex,ABC)法进行检测。一抗(兔抗 Spata3 多克隆抗体)1∶400,4℃孵育过夜;次日加生物素标记的山羊抗兔二抗(1∶200)室温孵育1 h;ABC 液37℃孵育30 min,最后DAB 显色、苏木素复染、脱水、透明、封片。光学显微镜观察结果,结果判定以出现棕黄色颗粒为阳性染色。所有实验均重复3 次。

1.2.7 免疫细胞荧光染色

睾丸组织曲精小管内细胞的间接免疫荧光染色分析主要参照文献[8]进行。取8 周龄BALB/c 雄性小鼠睾丸组织置于预冷的PBS 中,快速分离曲精小管,使用胶原酶消化成单细胞,取50 μL 涂片,室温晾干。山羊血清封闭1 h,一抗(兔抗Spata3 多克隆抗体)1∶200,4℃孵育过夜。次日加Cy3 标记的驴抗兔二抗(1∶400),37℃孵育1 h,漂洗后加20 μL 含4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的抗淬灭封片剂。荧光显微镜下观察拍照。上述实验均重复3 次。

2 结果

2.1 小鼠Spata3 基因及蛋白序列信息

2.1.1 基因信息小鼠Spata3 基因位于1 号染色体C5 区,基因全长15 542 bp,含有8 个外显子(见图1)。

图1 小鼠Spata3 基因在染色体中的位置Figure 1 Chromosome location of mouse Spata3

2.1.2 cDNA 信息

小鼠Spata3 的cDNA 全长1107 bp,碱基序列见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM _027300.4。其碱基组成及百分比:269 A(24.3%);347 C(31.3%);237 G(21.4%);254 T(22.9%)。开放阅读框起始于第105 位,止于第686 位,共582 bp,与人SPATA3 CDS 序列64%相同(见图2)。

图2 小鼠与人Spata3 CDS 比对结果Figure 2 Blast result of Spata3 CDS between mouse and human

2.1.3 蛋白质序列信息和理化性质

小鼠Spata3 蛋白质含有193 个氨基酸,分子式为C901H1449N277O269S15,相对分子质量为20 947.01,含有2911 个原子,氨基酸序列见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/170172533。利 用CLUSTALW 2.1 和ESPript 3.0 分析小鼠Spata3 的氨基酸的同源性,结果显示分别与人52.8%、猕猴53.9%、大鼠77.4%、黑猩猩44.1%同源(图3)。采用ProtParam tool 软件在线统计得到:其中脯氨酸占比最大(17.1%),丝氨酸次之(16.1%),色氨酸比例最小(1.0%)(见表1)。其中带负电氨基酸残基有10 个,带正电氨基酸残基有28 个。其等电点预测是9.83,呈碱性。其不稳定系数101.98,表示小鼠Spata3 可能是不稳定蛋白。

图3 小鼠与人、猕猴、黑猩猩Spata3 蛋白同源性比对结果Figure 3 Homologous comparison of Spata3 in mouse,human,macaque and pan troglodytes

表1 小鼠Spata3 蛋白氨基酸组成Table 1 Amino acids components of mouse Spata3

2.2 小鼠Spata3 蛋白的亲(疏)水性

小鼠Spata3 平均亲水性经ProtParam tool 软件计算为-0.806,脂肪系数48.03。采用ProtScale 软件梳理其氨基酸的亲疏水性,其中第 12～15 位的精氨酸亲水性最强,亲水性-3.487;而第104 位的亮氨酸疏水性最强,亲水性1.609。Spata3 蛋白氨基酸亲疏水性分布(图4)表明亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸,属于亲水性蛋白。

图4 小鼠Spata3 蛋白疏水性分析Note.Positive value represents hydrophobic area.Negative values represent hydrophilic area.Figure 4 Hydrophobicity analysis of mouse Spata3

2.3 小鼠Spata3 蛋白质的信号肽预测

运用SignalP 6.0 Server 软件进行信号肽预测,结果显示Signal Peptide(Sec/SPI)的值为0(o 线),Other 值为1.001,表明小鼠Spata3 蛋白无信号肽序列,为非分泌型蛋白,不跨胞膜运输(图5)。

图5 小鼠Spata3 蛋白信号肽预测Figure 5 Signal peptide prediction of mouse Spata3

2.4 小鼠Spata3 蛋白质的跨膜区域分析

应用TMHMM Server v.2.0 在线软件预测小鼠Spata3 的跨膜区。图6 中蓝色细线所对应的纵轴数值说明该蛋白质位于胞内的概率约0.63041,粉色细线相对应的纵坐标数值表示该蛋白质位于胞外的可能性约0.36959,无跨膜螺旋存在,蓝色粗线表示综合结果,位于胞内(总概率大于1),预测结果显示小鼠Spata3 蛋白属于非跨膜的胞内蛋白(图6)。

图6 小鼠Spata3 蛋白跨膜区预测Figure 6 Transmembrane region prediction of mouse Spata3

2.5 小鼠Spata3 蛋白质的二级结构预测

相似度阈值设置为8,通过SOPMA 软件分析小鼠Spata3 蛋白可能含有4 种二级结构:无规则卷曲为77.72%、α 螺旋为7.77%、延伸链为10.88%和β折叠为3.63%(图7)。采用GOR 4 预测其含有两种二级结构:无规则卷曲为87.05%和延伸链为12.95%(图8)。综上,小鼠Spata3 蛋白的主要结构为无规则卷曲和延伸链,无规卷曲结构可能与其功能发挥密切相关。

图7 小鼠Spata3 蛋白SOPMA 软件预测二级结构Figure 7 Secondary structure of mouse Spata3 by SOPMA software

图8 小鼠Spata3 蛋白GOR4 软件预测二级结构Figure 8 Secondary structure of mouse Spata3 by GOR4 software

2.6 小鼠Spata3 蛋白的三级结构预测分析

通过Rosetta 软件从头计算的方法进行三维空间结构预测,从图9A 可见小鼠Spata3 蛋白存在大量无规则卷曲结构,α 螺旋数量较少,符合二级结构预测结果。此三维结构模型的可信度是0.44,总误差分析在5～25 埃之间(图9B)。

图9 小鼠Spata3 蛋白Rosetta 软件三级结构建模分析Note.A.The model of tertiary structure.B.The curve of angstroms error estimate.Figure 9 Tertiary structure and model analysis of mouse Spata3 by Rosetta software

2.7 小鼠Spata3 蛋白质结构域

利用Uniprot 网站分析蛋白结构域。数据库结果显示小鼠Spata3 蛋白1～92 属于无序区域,与Novopro 蛋白质固有无序区域预测结果相符(图10)。组成特征表现为16～33 为极性氨基酸残基区、34～51、64～91 为富含脯氨酸残基区。内在无序区域与蛋白在细胞内的相变聚集及功能发挥密切相关,另外脯氨酸富集区可能提供了SH3结构域的识别位点。

图10 小鼠Spata3 蛋白无序结构域预测Note.A.The schematic diagram of sequence.B.The prediction of protein disorder region.Figure 10 Disordered domain prediction of mouse Spata3

2.8 小鼠Spata3 蛋白磷酸化修饰位点

NetPhos 3.1 软件在线分析蛋白潜在磷酸化位点,阈值设定为0.5,小鼠Spata3 蛋白含有30 个潜在磷酸化位点。其中丝氨酸位点占大多数,有25个;苏氨酸位点仅5 个;酪氨酸可能无磷酸化。糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3,GSK3β)等激酶能够催化相应位点磷酸化(图11)。

图11 小鼠Spata3 蛋白潜在磷酸化位点Figure 11 Phosphorylation site prediction of mouse Spata3

2.9 小鼠Spata3 蛋白N/O-糖基化位点预测

N-型糖基化位点经NetNGlyc1.0 在线软件预测显示没有N-型糖基化位点(图12A)。YinOYang1.2在线软件分析得出小鼠Spata3 蛋白有11 个可能的O-型糖基化位点(图12B)。

图12 小鼠Spata3 蛋白N-/O-糖基化位点分布Note.A.N-glycosylation potential site.B.O-glycosylation potential site.Figure 12 N-/O-glycosylation site prediction of mouse Spata3

2.10 小鼠Spata3 蛋白在组织中的表达分析

利用NCBI 网站基因表达谱分析显示小鼠Spata3 在睾丸组织中大量表达,附睾有少量表达,其它组织中未发现表达(图13)。

图13 小鼠Spata3 蛋白组织定位Figure 13 Tissue localization of mouse Spata3

2.11 小鼠Spata3 蛋白在睾丸细胞中的表达分析

通过GEO 数据库分析显示小鼠spata3 在精子发育的各阶段细胞具有表达,并且圆形精子细胞表达较高(图14A)。我们对8 周雄性小鼠睾丸组织进行免疫组织化学染色,结果显示小鼠Spata3 蛋白染色阳性呈棕黄色颗粒,主要出现在曲精小管的圆形和长形精子细胞,精母细胞呈弱阳性,但精原细胞、间质细胞及支持细胞未检测到阳性信号(图14B)。

图14 小鼠Spata3 蛋白在精子发育各阶段细胞表达Note.A.The GEO analysis of cell expression.B.Immunohistochemical detection.Figure 14 Cell expression pattern of mouse Spata3 in spermatogenesis

2.12 小鼠Spata3 蛋白质的亚细胞定位及核定位序列

利用PSORT 软件,选择PSORT II Prediction,预测分析蛋白的亚细胞定位,结果显示小鼠Spata3 定位于细胞核、线粒体、细胞质和细胞骨架,概率分别为:73.9%、13.0%、8.7%和4.3%。利用NLStradamus 分析Spata3 蛋白的核定位序列为 2-KKVKKK KSDSRRRRN-16(预测阈值标准0.6)。The Human Protein Atlas 数据库预测蛋白极可能存在于细胞核内。收集曲精小管消化细胞进行免疫荧光染色实验,结果显示红色荧光标记的Spata3 蛋白主要集中在圆形精子和长形精子细胞胞核和胞质(图15)。

图15 小鼠Spata3 蛋白在精子细胞中的定位Note.A.Round spermatids.B.Elongate spermatids.White arrow indicates nuclear.Green arrow indicates cytoplasm.Figure 15 Subcellular localization of mouse Spata3 in spermatids

2.13 小鼠Spata3 蛋白功能和相互作用预测

利用NetGO 3.0 对蛋白功能进行分析,小鼠Spata3 分子功能是与蛋白和核酸的结合,分值大于0.7;细胞组分是位于胞质和核内,分值大于0.7;生物学通路主要参与细胞分化、有性生殖等,相关性大于0.6(图16)。进一步通过STRING 数据库预测可能与小鼠Spata3 互作的蛋白质,交互数量阈值设置为10,建构互作蛋白质的网络图,结果显示小鼠Spata3 与Spata1、Spata9、Spata20、Spata25、Spata46、Tmem225、Fam71f 等有相互作用(图17),相关度均高于0.6。

图16 小鼠Spata3 参与的生物学通路Note.The color represents correlation.Red (1.0～0.9),brown (0.9～0.8),blue (0.8～0.7),green (0.7～0.6),black (0.6～0).Figure 16 Biological process predication of mouse Spata3

图17 小鼠Spata3 蛋白相互作用预测Figure 17 Interactional proteins predication of mouse Spata3

3 讨论

精子发生是由精原细胞通过有丝分裂、减数分裂和精子变形等一系列高度有序的生理过程最后形成成熟的精子[9-10]。精子发育障碍是引起男性不育的主要原因,但目前对参与这一高度有序发育过程的分子和相关调控机制仍认识不足。Spata3 基因是利用抑制消减杂交方法筛选的差异表达基因并发现在小鼠隐睾组织表达较正常组织升高,推测其可能与生精细胞凋亡有关[1]。随后在非梗阻性无精症患者的睾丸组织检测发现Spata3 表达较正常组织显著降低[2]。近年有研究者利用全外显子突变谱分析发现Spata3 外显子突变位点与男性前列腺癌[11]的发生相关,采用CRISPR/Cas 技术敲除Spata3 基因后小鼠精子形态明显改变,体外受精能力减弱[3]。综合上述文献,提示Spata3 在精子的发育过程中具有重要功能。我们课题团队十余年来亦致力于Spata3 的研究工作,明确了小鼠Spata3 的睾丸组织表达,在细胞实验中发现Spata3 对细胞凋亡无影响,但能够促进自噬的发生[4],这与前述文献报道的Spata3 与凋亡相关存在偏差。而且目前对Spata3 基因发挥生物学功能的分子机制研究未见相关的文献报道,因此需要重新系统的梳理认识Spata3 的特性。

目前一般先通过生物信息学技术对功能不详的基因进行分析预测,以获得相关基因及其蛋白质的基本情况,再结合实验研究来验证该基因的可能作用机制。本文利用生物信息学方法首先对Spata3的基因和氨基酸序列进行了比对分析,发现小鼠Spata3 蛋白在人类有同源蛋白,同源性较高,约64%,而且与猕猴、黑猩猩的也具有较高同源性,表明Spata3 是哺乳动物精子发生过程中的保守蛋白,这为以小鼠作为模型研究其功能和机制奠定了基础。利用ExPASy 系统的ProtParam tool 等软件分析得出小鼠Spata3 是碱性亲水蛋白质,稳定性较差、无信号肽和跨膜区。通过SOPMA、GOR 4 等预测结果显示Spata3 二级结构主要为无规则卷曲,三级结构特征是N 端的内在无序区,染色实验结果显示其亚细胞定位于胞核和胞质。这种碱性蛋白在胞核易于和染色体结合,有可能通过其内在无序区相变聚集而发挥功能[12]。生物学功能预测Spata3 主要参与细胞分化、有性生殖等,进一步利用STRING 软件蛋白质相互作用分析推测其可能与Spata46、Spert等蛋白质相互作用。Spata46 是特异性表达定位于顶体下区核膜中的跨膜蛋白,Chen 等[13]研究显示其参与精子头部重塑和精卵融合。缺失Spata46 引起精子头部形状异常和精卵融合失败,导致雄性不育。因此我们推测Spata3 可能与互作蛋白结合参与精子发生和变形的精细调控。

我们利用生物信息学方法对鼠Spata3 的基因和氨基酸序列进行了比对,预测了其理化特性和三维空间构象等信息,初步验证了其细胞组织定位。鼠Spata3 蛋白质可能通过与Spata46、Spert 等蛋白质相互作用,从而参与精子发生过程。