白酒中三氯蔗糖的HPLC及UPLC-MS/MS检测对比研究

马雪丰，陈 果，唐韵熙，秦德萍

（重庆市食品药品检验检测研究院，重庆 401121）

三氯蔗糖（sucralose），又名蔗糖素，相对分子质量为396.01，具有高稳定性、高甜度（等量蔗糖的600倍）、甜味纯正、零热量、不被人体吸收、不引起龋齿等优点[1-3]，因此被广泛应用到调味乳、糖果、果酱、冷冻饮品、水果干、酱、醋、配制酒、浓缩果汁等加工食品中[4-6]。但三氯蔗糖不是天然成分，若超量使用，可能会引起各种形式的毒性表现[7-8]。现我国在《食品添加剂使用标准》（GB 2760-2014）中规定不允许三氯蔗糖添加至蒸馏酒中[9]。但一些白酒生产企业为迎合消费者需求，在白酒中加入三氯蔗糖改善酒体口感，从而赚取高额利润，干扰了行业的健康发展[10-11]。近年，在国家有关部门对全国白酒的抽检中，时常有滥用三氯蔗糖的现象发生。目前，文献报道检测三氯蔗糖的方法主要有离子色谱法[12-13]、高效液相色谱法（HPLC）[14-16]、液相色谱质谱联用法[17-18]等。其中国家标准中使用的是HPLC，该方法灵敏度较低，选择性较差，且存在着易出现假阳性等问题。鉴于此，本文利用超高效液相色谱质谱联用法（UPLCMS/MS）具有高选择性、高灵敏度及能提供相对分子质量与结构信息的优点，对白酒中三氯蔗糖进行检测，并与HPLC进行对比。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪（配示差检测器，美国Agilent公司）； Agilent 1290-API 4000液相色谱-质谱联用仪（美国AB公司）；恒温水浴锅（江苏金坛中大仪器厂）。

1.2 试药

样品：市售白酒。

试剂：三氯蔗糖对照品（Sigma-Aldrich公司），乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）；甲醇（色谱醇，德国Merck公司）；甲酸（色谱纯，美国Fisher公司）；其余试剂均为国产分析纯；超纯水由Milli-Q水纯化设备自制。

2 方法

2.1 对照品溶液的配制

精密称取三氯蔗糖对照品0.01000 g，置于10 ml量瓶中，用超纯水溶解并定容至刻度，摇匀，配制成浓度为1.00 mg/ml的对照品储备液。将对照品储备液用超纯水逐级稀释，得到质量浓度分别为0.020，0.050，0.100，0.200，0.400 mg/ml的系列对照品溶液，待HPLC测定；质量浓度分别为20.0，40.0，80.0，100.0，200.0，400.0 ng/ml的系列对照品溶液，待UPLC-MS/MS测定。

2.2 样品前处理方法

2.2.1 HPLC 称取样品5 g（精确到0.01 g），置于蒸发皿中，于沸水浴上蒸至近干，将残渣用1.00 ml水溶解，经0.45 μm滤膜过滤入样品瓶中，待上机分析。

2.2.2 UPLC-MS/MS 称取样品5 g（精确到0.01 g），置10 ml量瓶中，用水混匀后定容至刻度，用0.22 m滤膜过滤入样品瓶中，待上机分析。

2.3 HPLC分析条件

色谱柱：Waters Symmetry Shield C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（15:85），等度洗脱；流速：1.0 ml/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μl；示差检测器检测池温度：35 ℃。

2.4 UPLC-MS/MS分析条件

UPLC条件：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：A：0.1 %甲酸水溶液，B：甲醇，梯度洗脱，洗脱程序见表1；柱温：30 ℃；进样量：5 μl。

表1 液相色谱梯度洗脱条件

质谱条件：离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：负离子模式；检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾（IS）电压：-4500 V；雾化气（GS1）压力： 55 psi；气帘气（CUR）压力：25 psi；辅助气（GS2）压力：55 psi；离子源温度：500 ℃；定性离子对、定量离子对、去簇电压（DP）、碰撞气能量（CE）见表2。

表2 MRM条件

3 结果与讨论

3.1 两种方法前处理及检测条件的优化

3.1.1 HPLC 三氯蔗糖在紫外光区无特征吸收峰，因此采用示差折光通用检测器进行测定。但该检测器选择性差，白酒中的主要成分乙醇和一些微量的芳香族化合物对液相系统产生基质干扰，影响目标物质的分离。因此将待测酒样经水浴蒸发去除醇类等易挥发组分，再通过优化流动相中乙腈的比例使目标物质三氯蔗糖得到分离（见图1）。从图1可见三氯蔗糖峰位处平稳清晰，无其他峰的出现。

图1 空白溶剂（A）、对照品溶液（B）、加标样液（C）的HPLC图谱

3.1.2 UPLC-MS/MS 将样品稀释后直接分析。分别考察流动相0.1 %乙酸水溶液-甲醇（40:60）、10 mmol/L乙酸胺水溶液-甲醇梯度洗脱、0.1 %甲酸水溶液-甲醇梯度洗脱3种洗脱条件对目标物质检测的影响。结果发现采用0.1 %甲酸水溶液-甲醇梯度洗脱，峰形良好，干扰少（见图2）。采用多反应检测（MRM）模式进行测定，具有选择性高、特异性强的特点，避免了液相色谱仅通过色谱峰的保留时间定性而导致假阳性的可能。

3.2 两种方法回归方程、线性关系和检出限的比较

分别采用HPLC和UPLC-MS/MS测定三氯蔗糖系列对照品溶液。以浓度为横坐标（X）、其相应峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得到标准曲线方程及相关系数（r）。以3 倍信噪比对应的浓度为检出限，10倍信噪比对应的浓度为定量限。两种方法回归方程、线性范围和检出限见表3。对比两种方法，UPLC-MS/MS方便快捷，检出限更低。因此UPLC-MS/MS测定白酒中的三氯蔗糖更具优势。

表3 三氯蔗糖的标准曲线、线性范围和检出限、定量限

3.3 两种方法回收率和精密度的比较

选取空白样品，加入三氯蔗糖对照品溶液进行加标回收试验。加标浓度分为低、中、高3个水平，每个水平重复6次。计算回收率和RSD，结果见表1。结果显示两种方法回收率良和精密度良好，但UPLC-MS/MS的灵敏度更高，可用于白酒中痕量三氯蔗糖的检测。

表4 加样回收试验结果（n=6）

3.4 样品的测定

采用HPLC和UPLC-MS/MS分别对10个白酒样品进行检测，结果见表5。结果HPLC未检出三氯蔗糖；UPLC-MS/MS检出3号白酒中添加微量三氯蔗糖。

表5 样品测定结果

4 结论

本文对HPLC和UPLC-MS/MS测定白酒中三氯蔗糖的检测方法进行比较，结果显示UPLC-MS/MS前处理简单快捷，定性更加准确，且灵敏度高，能满足白酒中三氯蔗糖的检测要求。