高迁移率族蛋白B1对人支气管上皮细胞的炎症因子和受体表达的影响

梁 悦 薛艳龙 杨超勉 黄天霞 陈一强

1.南宁市第一人民医院呼吸与危重症医学科，广西南宁 530028；2.广西医科大学第一附属医院 广西医科大学呼吸疾病研究所，广西南宁 530021

高迁移率族蛋白B 1（high-mobility group box 1，HMGB1）是广泛存在于几乎所有细胞类型的细胞核和细胞质中的一种高度保守蛋白，它可以调控多种炎症反应[1]。已有相关研究证明HMGB1参与了气道慢性炎症性疾病的发病，如在支气管哮喘（简称“哮喘”）患者血清中，HMGB1表达水平较健康人群明显升高[2]。但HMGB1参与哮喘炎症反应的机制还有待进一步探讨。

哮喘是一种常见的气道慢性炎症性疾病，因不同的临床特征和体内不同的分子机制而表现出发病的异质性[3]。其中支气管上皮细胞（16-HBE）是近年来机制研究的重点[4]，它参与哮喘气道炎症反应机制不明。有研究表明16-HBE可释放白介素-8（interleukin-8，IL-8）等多种炎症因子[5]，且16-HBE存在多种HMGB1相关受体[6]。因此本研究通过建立体外细胞模型，研究HMGB1对16-HBE释放炎症因子和受体表达的影响，以证实HMGB1是否可能通过干预这一途径来参与哮喘气道炎症的发生。

1 材料与方法

1.1 实验细胞

实验所用16-HBE购自欧洲标准细胞收藏中心（ECACC）。

1.2 实验主要仪器和试剂

Mutiskan酶标仪（美国 Thermo），Western blot设备（美国Bio-Rad），Odyssey双色红外荧光成像系统（美国 Licor），重组型 HMGB1（美国 Sigma，批号：H4653），IL-8、基质金属蛋白酶 -9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、胸 腺 基 质 淋 巴 生成 素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）、血 管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）Human酶联免疫吸附实验法（ELISA）试剂盒（武汉博士德，批号：EK0413、EK0465、EK0958、EK0539），高级糖基化终产物受体（receptor for advanced glycation end products，RAGE）、Toll样受体 2（toll-like receptor 2，TLR2）、Toll样受体 4（toll-like receptor 4，TLR4）抗体（美国GeneTex，批号：821904539、821904830、821403584），IRDye800CWIgG荧光羊抗兔二抗（美国Licor，批号：926-32211）。

1.3 实验方法

1.3.1 HMGB1对16-HBE释放炎症因子和受体的影响 将细胞放入含15%胎牛血清的1640培养基中并置于细胞培养箱中培养、传代。细胞按随机数表法设置为对照组a（不含HMGB1的培养基）、HMGB1-100 ng/ml组、HMGB1-500 ng/ml组、HMGB1-2000 ng/ml组a[7]，培养上述分组细胞48 h。分别收集以上分组细胞的培养上清和细胞裂解液。采用ELISA检测16-HBE中IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF的释放水平，用蛋白质印迹法（Western blot）检测细胞裂解液中RAGE、TLR2、TLR4蛋白水平。

1.3.2 受体活化和炎症因子表达之间的关系 根据第一阶段实验可确定HMGB1增加表达的受体。按照上述培养传代方法处理16-HBE后，将细胞按随机数表法设置对照组b（不含HMGB1的培养基）、HMGB1-2000 ng/ml组b、RAGE 拮抗组（anti-RAGE组）、anti-RAGE+HMGB1-2000 ng/ml组[8]，培养上述分组细胞48 h。分别收集以上分组细胞的培养上清。用ELISA检测细胞上清中IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF的释放水平。

1.4 统计学处理

所有数据均采用SPSS 16.0统计学软件进行处理，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），各组间多重比较方差齐性时采用LSD-t检验，方差不齐时采用Dunnett’s T3法检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HMGB1对16-HBE释放IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF的影响

与 对 照 组a比 较，HMGB1-500 ng/ml组 和HMGB1-2000 ng/ml组a显著增加16-HBE的IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF释放，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表1。

表1 HMGB1对16-HBE释放IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF的影响（pg/ml，n=4，±s）

表1 HMGB1对16-HBE释放IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF的影响（pg/ml，n=4，±s）

注 与对照组a比较，*P ＞ 0.05，**P ＜ 0.05；IL-8：白介素-8；MMP-9：基质金属蛋白酶-9；TSLP：胸腺基质淋巴生成素；VEGF：血管内皮生长因子

组别 IL-8 MMP-9 TSLP VEGF对照组a 141.915±10.615 244.542±6.061 24.089±2.861 211.812±6.105 HMGB1-100 ng/ml组 155.284±3.002* 250.366±7.930* 34.113±2.407* 225.453±5.697*HMGB1-500 ng/ml组 233.633±10.453** 405.304±8.443** 82.698±14.150** 356.607±7.081**HMGB1-2000 ng/ml组 a 280.413±6.450** 508.745±8.747** 121.344±10.733** 462.833±8.237**F值 142.792 472.843 453.872 450.603 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 HMGB1对16-HBE的RAGE、TLR2、TLR4受体蛋白表达的影响

与对照组a比较，HMGB1各浓度干预组不能增加TLR2、TLR4蛋白的表达，HMGB1-500 ng/ml组和HMGB1-2000 ng/ml组a明显增加16-HBE的RAGE蛋白表达，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见图1，表2。

表2 HMGB1对16-HBE的RAGE、TLR2、TLR4蛋白表达的影响（n=4，±s）

表2 HMGB1对16-HBE的RAGE、TLR2、TLR4蛋白表达的影响（n=4，±s）

注 与对照组 a比较，*P ＞ 0.05，**P ＜ 0.05；RAGE：高级糖基化终产物受体；TLR2：Toll样受体2；TLR4：Toll样受体4

组别 RAGE TLR2 TLR4对照组a 0.533±0.046 0.547±0.0600.023±0.003 HMGB1-100 ng/ml组 0.538±0.048*0.562±0.0380.025±0.005 HMGB1-500 ng/ml组 0.925±0.054**0.569±0.0500.023±0.006 HMGB1-2000 ng/ml组 a 2.130±0.138**0.583±0.0110.027±0.004 F值 496.433 1.757 0.857 P值 0.000 0.188 0.479

图1 不同浓度HMGB1对16-HBE的RAGE、TLR2、TLR4蛋白表达的影响

2.3 拮抗RAGE受体后HMGB1对16-HBE的IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF释放影响

与 HMGB1-2000 ng/ml组b比较，anti-RAGE+HMGB1-2000 ng/ml组能明显减少16-HBE的IL-8、TSLP、MMP-9、VEGF释放，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。显示HMGB1可依赖RAGE增加16-HBE的 IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF 释放。见表3。

表3 拮抗RAGE受体后HMGB1对16-HBE的IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF释放的影响（pg/ml，n=4，±s）

表3 拮抗RAGE受体后HMGB1对16-HBE的IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF释放的影响（pg/ml，n=4，±s）

注 与HMGB1-2000 ng/ml组b比较，**P ＜ 0.05；IL-8：白介素-8；MMP-9：基质金属蛋白酶-9；TSLP：胸腺基质淋巴生成素；VEGF：血管内皮生长因子

组别 IL-8 MMP-9 TSLP VEGF对照组b 145.023±7.135 241.453±7.925 25.270±5.279 215.519±6.914 HMGB1-2000 ng/ml组 b 284.442±6.133 504.075±12.405 120.592±9.349 456.742±10.088 anti-RAGE 组 156.034±6.856 249.120±5.817 30.319±4.067 219.572±4.752 anti-RAGE+HMGB1-2000 ng/ml组 185.374±7.127** 359.612±8.696** 71.981±6.781** 256.832±8.024**F值 608.611 1110.253 393.111 1284.402 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

3 讨论

HMGB1是一种普遍存在的核蛋白，在既往研 究 中，脂多 糖（lipopolysaccharide，LPS）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等促炎因子需与HMGB1结合才能发挥完全毒性，如HMGB1+LPS可增强巨噬细胞的炎症反应而参与调控急性肺损伤的过程[9]；HMGB1+IL-1β复合物通过活化Toll样受体信号促进人椎间盘细胞炎性细胞因子的释放[10]。本研究中，HMGB1的高浓度刺激可以增加16-HBE中 IL-8、TSLP、MMP-9、VEGF的释放，这也说明了HMGB1在体外细胞实验中仍可能具有一定的促炎作用。而上述炎症因子在哮喘的气道炎症中可诱导不同的生物学效应。因此，推测HMGB1可能通过对16-HBE的炎症调控来参与哮喘的发病。

以往的研究表明，RAGE和Toll样受体是HMGB1信号通路中的主要受体HMGB1+LPS、HMGB1+IL-1β复合物皆可通过活化上述受体发挥强大的促炎能力[11]。本研究提示HMGB1-RAGE信号表达的增加可激活16-HBE的炎症反应，因RAGE在肺组织中高表达，所以高浓度的HMGB1可能首先影响RAGE信号的表达。通过蛋白质印迹实验的显影猜测，16-HBE表达Toll样受体蛋白浓度较RAGE低，而HMGB1可能因有限的促炎作用而难以直接影响Toll样受体的表达。HMGB1-RAGE信号的表达在哮喘发病中有重要意义：HMGB1、RAGE水平被证实与哮喘的严重性呈正相关[12]。而已有相关研究证实RAGE基因的单核苷酸多态性与哮喘发病率增加有关[13]。实际上，HMGB1的效应细胞多种多样，不同细胞表达受体种类和数目也不尽相同，实验样本来源的多样性可能导致HMGB1-RAGE或HMGB1-Toll样受体信号表达情况的不同。如在哮喘小鼠模型中，HMGB1就可通过激活树突状细胞中的TLR2、TLR4、RAGE受体，间接促进辅助2型T细胞、辅助型T细胞17分化，从而加剧该小鼠哮喘模型中气道的炎症反应[14]。HMGB1及其信号通路在多种炎症相关疾病中有重要地位，HMGB1靶向治疗在许多实验室炎症模型中已取得成功[15]，但尚未进行HMGB1特异性药物的临床试验。本研究表明HMGB1及其相关信号的异常表达可能是哮喘的重要发病机制之一，阻断该信号的异常表达将可能减轻哮喘的气道炎症反应。而HMGB1参与调控哮喘的机制还有待进一步研究，以更好地为治疗哮喘提供新的理论支持。