耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的耐药性及耐药基因分布特点研究

王艳艳，高翔宇，王颖君，吕莹莹，韩艳秋，兰海霞，王俊瑞*

1内蒙古医科大学附属医院检验科，呼和浩特 010050；2解放军第九六九医院儿科，呼和浩特 010051

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）为非发酵革兰阴性杆菌，广泛存在于自然界，是定植于人体呼吸道及皮肤表面等部位的条件致病菌，在宿主免疫力低下等情况下易引起多种感染性疾病，如呼吸道感染、泌尿生殖道感染、伤口感染和败血症等［1-3］。近年来，碳青霉烯类抗菌药物被广泛用于治疗细菌感染性疾病，耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌（carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）感染患者数呈逐年增多的趋势，多重耐药（multi-drug resistant，MDR）及泛耐药（pan-drug resistant，PDR）鲍曼不动杆菌的广泛流行给临床抗感染治疗带来巨大挑战［4-7］。有研究显示，产碳青霉烯酶是鲍曼不动杆菌最主要的耐药机制之一［8］。本研究拟通过对本院2013年9月～2021年2月分离的100株CRAB菌株的分布及耐药性进行统计，分析其耐药基因分布情况，并初步探究菌株对碳青霉烯类药物的耐药机制，为CRAB的有效治疗及医院感染防控提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

选取从2013年9月～2021年2月期间本院收治患者的临床标本中分离的100株CRAB菌株，剔除同一患者重复菌株。

1.2 仪器与试剂

IMH750-S型微生物培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）；VITEK2-Compact全自动微生物鉴定仪及其配套试剂（法国Bio-M é rieux公司）；microTyper MALDI-TOF质谱仪（江苏天瑞仪器有限公司厦门分公司）；Effiency96型PCR扩增仪（北京领宇科技有限公司）；PowerPacTMBasic型电泳仪（美国Bio-Rad公司）；Gel Doc XR+型凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司）。

MH琼脂粉（英国Oxoid公司，批号：2846108）；替加环素药敏试剂（温州康泰生物科技有限公司，批号：VG1213JA）；VITEK2-Compact全自动微生物鉴定仪及配套试剂GN16卡（法国Bio-M é rieux公司，批号：1132013503）；药敏试纸［温州康泰生物科技有限公司，批号：331353（美罗培南）、3354894（头孢哌酮/舒巴坦）］；引物、MasterMix、DNA Marker（大连TaKaRa生物工程有限公司，批号：#S7621）；细菌基因组 DNA 提取试剂盒（天根生化科技有限公司，批号：W0130）；质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853，均购自国家卫生健康委临床检验中心。

1.3 细菌鉴定及药敏试验

菌株的分离、培养参照《临床微生物检验标准化操作》（第三版）［9］进行，采用 VITEK 2-Compact全自动微生物鉴定/药敏系统及microTyper MALDI-TOF质谱仪进行鉴定和复核。药敏试验中，头孢哌酮/舒巴坦、美罗培南采用K-B纸片扩散法进行药敏试验；替加环素采用微量肉汤稀释法进行药敏试验；其他抗菌药物采用VITEK 2-Compact全自动微生物系统鉴定/药敏系统进行药敏试验。抗菌药物浓度均为GN16卡片中的浓度范围：头孢吡肟（2～16μg/ml）、亚胺培南（1～32μg/ml）、妥布霉素（4～16μg/ml）、阿米卡星（16～64μg/ml）、复方磺胺甲唑（ 甲氧苄啶2～4mg/ml、磺胺甲唑 38～76μg/ml）、庆大霉素（4～16μg/ml）、环丙沙星（1～4μg/ml）、头孢曲松（1～4μg/ml）、左氧氟沙星（2～8μg/ml）和替加环素（0.5～8μg/ml）。结果判定参照美国临床与实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M100-S32 版文件［10］。

1.4 碳青霉烯酶基因检测

按照DNA提取试剂盒的操作步骤，提取100株CRAB菌株的全基因组DNA，并置于-20℃保存备用。引物及反应条件参照文献进行设计［11-15］，包括D类碳青霉烯酶基因（blaOXA-23，blaOXA-24，blaOXA-51，blaOXA-58，blaOXA-143和blaOXA-48）、B 类碳青霉烯酶基因（blaIPM，blaVIM，blaNDM，blaGIM和blaSIM）、A 类碳青霉烯酶基因（blaKPC-2）［8］和插入序列（ISAba1）共13对引物序列，详见表1。

表1 PCR引物序列

1.5 统计学方法

采用WHONET 5.6软件对药敏结果进行分析，计数资料以n（%）表示。

2 结果

2.1 CRAB菌株的标本来源分布

100株CRAB菌株来源于8种不同的临床标本，其中痰液标本最多（75株，75.0%）；其次是尿液标本（8株，8.0%）；伤口分泌物和脓汁标本均为6株（6.0%）。具体标本来源分布及构成比见表2。

表2 CRAB菌株的标本来源分布情况

2.2 CRAB菌株的临床科室来源分布

100株CRAB菌株的主要临床科室来源为重症加强护理病房（intensive care unit，ICU），有30株（30.0%）；其次为神经外科（24株，24.%）、康复科（13株，13.0%）、呼吸内科（9株，9.0%）。CRAB菌株的临床科室来源分布及构成比详见表3。

表3 CRAB菌株的临床科室来源分布情况

续表

2.3 CRAB对常用抗菌药物耐药情况

本研究中，100株CRAB菌株对头孢曲松、头孢吡肟和环丙沙星的耐药率均为100%；庆大霉素耐药率为90.0%；头孢哌酮/舒巴坦耐药率为62.0%，中介率为35.0%，敏感率仅为3.0%（以头孢哌酮折点为参考判断敏感或耐药）；阿米卡星耐药率较低，仅为33.0%；未发现对替加环素耐药的菌株。CRAB对常用抗菌药物的耐药情况见表4。

表4 CRAB对常用抗菌药物的耐药情况 n（%）

2.4 碳青霉烯酶基因检测结果

PCR检测结果显示，100株CRAB菌株中，97株扩增出blaOXA-23（97.0%）；94株扩增出blaOXA-51（94.0%）；1 株扩增出blaOXA-58（1.0%）；4株扩增出blaNDM（4.0%）；1株扩增出blaIPM（1.0%）；99株扩增出ISAba1（99.0%）；另外，blaOXA-24、blaOXA-143、blaOXA-48、blaKPC-2、blaSIM、blaVIM和blaGIM均未检出，结果见图1。

图1 碳青霉烯类基因检测阳性率情况

3 讨论

鲍曼不动杆菌是不动杆菌属中最常见的一种革兰阴性杆菌，具有较强的存活力和抵抗力，已成为威胁全球人类健康的一类重要病原菌，尤其对老年、患危重疾病、机体抵抗力弱及进行各种侵入性操作、长期使用广谱抗菌药物治疗的患者威胁更大［2，14-15］。2020年全国细菌耐药监测报告显示［16］，鲍曼不动杆菌的分离率在革兰阴性菌中排名第4位，其对碳青霉烯类药物的耐药率基本稳定，全国平均耐药率为53.7%，较2019年下降了2.3%；地区间有一定的差别，其中河南省最高（78.5%），青海省最低（18.2%）；值得注意的是，内蒙古地区处在中间水平，平均耐药率为54.7%，但较2019年下降了1.8%。世界卫生组织（WHO）于2017年公布的新型抗菌药物研发重点病原体清单中，CRAB居革兰阴性菌之首。CRAB感染不仅可造成较高的病死率、提高医疗保健和治疗费用负担，还给遏制微生物耐药性和耐药菌传播、临床感染防控等方面带来了严峻挑战［17-18］。

因鲍曼不动杆菌具有极强的获得耐药能力，已成为医院内暴发感染的重要致病菌，且分离率不断提高、耐药程度越来越严重［2］。CRAB对多种常用抗菌药物均耐药，呈PDR或全耐药趋势［19］。本研究对100株CRAB菌株进行耐药性分析，结果显示CRAB对头孢吡肟、头孢曲松、环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率均为100%，与国内部分研究报道一致［20-21］；对阿米卡星、妥布霉素、复方磺胺甲唑、头孢哌酮/舒巴坦和庆大霉素的耐药率均低于国内其他地区相关报道［20-21］，这可能与内蒙古地区的特殊地理位置、人口构成或本研究纳入菌株数有限有关。此外，由于自动化仪器法检测替加环素耐药性的局限性，本研究采用微量肉汤稀释法进行检测，发现本院CRAB菌株对替加环素仍保持高敏感性，未发现中介或耐药株。

鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物的耐药机制包括产碳青霉烯酶、青霉素结合蛋白改变、膜孔道蛋白缺失、药物主动外排泵的过度表达等，产碳青霉烯酶是其主要机制之一［8］。根据Ambler分类法，碳青霉烯酶可以分为A、B、C和D共4类。目前，在鲍曼不动杆菌临床株中，主要有A、B和D这3类碳青霉烯酶［8］。A类碳青霉烯酶的活性位点含丝氨酸残基，故也称为丝氨酸酶。B类碳青霉烯酶是依赖于金属锌的β内酰胺酶，命名为金属β内酰胺酶（metallo beta lactamase，MBL），典型代表为VIM、IPM和NDM型酶等。到目前为止，VIM、IPM和NDM已在我国、亚洲其他国家、欧洲等多个国家和地区的鲍曼不动杆菌中检出，并出现多起医院感染的暴发流行［22］。另外，MBL可通过整合子或质粒介导方式进行水平传播，容易引起更广泛地传播。D类碳青霉烯酶被称为苯唑西林酶（oxacilllinase，OXA），与MBL相比，OXA对碳青霉烯类药物的水解活性低，但当编码基因的上游或下游存在插入序列（insertion sequence，IS）时，耐药基因可高度表达，表现出对碳青霉烯类药物的高水平耐药［23］。由于各个国家和地区使用的抗菌药物存在差异，不同地区的鲍曼不动杆菌耐药谱也有不同，其所携带的耐药基因构成比亦不同［8］，故本研究检测了12种主要编码碳青霉烯酶的耐药基因以及1种插入序列，以分析本医院分离CRAB中碳青霉烯酶基因分布特点。研究结果显示，D类碳青霉烯酶是鲍曼不动杆菌中分布最多的β-内酰胺酶。本研究结果显示94.0%的CRAB菌株携带blaOXA-51基因，与已有研究结果相同［22］，提示blaOXA-51样碳青霉烯酶在鲍曼不动杆菌中普遍存在。据报道，许多鲍曼不动杆菌株常携带2种或2种以上碳青霉烯酶［20］，blaOXA-51样碳青霉烯酶是否以固有方式存在仍有待进一步证实。同时，该菌对碳青霉烯类耐药可能并不完全由blaOXA-51样碳青霉烯酶介导，因为大部分CRAB常常同时产生blaOXA-23样、blaOXA-24样、blaOXA-58样碳青霉烯酶，而文献报道这些酶的产生可以提高CRAB菌株对碳青霉烯类抗菌药物的耐药程度［24］。本研究显示，在100株CRAB中，97株（97.0%）检出了blaOXA-23型基因，1株（1.0%） 检出了blaOXA-58型基因，分离率与国内相关报道一致［19-20］，提示blaOXA-23同样是本院分离的CRAB携带的主要碳青霉烯类基因，这可能是引起鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药的主要原因之一。目前，可水平传播的MBL在铜绿假单胞菌、肠杆菌科菌株及鲍曼不动杆菌中可快速增加，最常见的酶是IPM、VIM、SIM、NDM［25］。本研究中NDM和IPM型酶较少，检出率分别为4.0%和1.0%。另外，有2株CRAB未检出上述耐药基因，提示可能存在其他类型的碳青霉烯基因，或具有外膜蛋白缺失、主动外排泵过度表达等其他耐药机制，仍有待进一步验证。

2001年，研究人员在鲍曼不动杆菌中发现了一个新的插入序列ISAba1，该序列位于编码blaADC基因［25］和blaOXA-23基因的上游。该序列包括2个开放阅读框（open reading frame，ORF），在形成有效和有功能的转座酶时可出现移码，表明其具备调控基因转录的功能［25］。blaOXA-51样碳青霉烯酶往往表达很弱，但上游启动子存在插入序列ISAba1时其表达可明显上调。已有研究证实，ISAba1一旦位于特定基因的上游就会发挥启动子功能，促进该基因的表达［24，26］。本研究中，ISAba1检出率为99.0%，说明ISAba1可能在CRAB株中对D类碳青霉烯酶编码基因的转录起着重要的调控作用。

综上所述，本院分离的CRAB菌株对多种非β-内酰胺类抗菌药物均耐药，仅对替加环素完全敏感，产OXA-23和OXA-51型酶可能是介导本院CRAB菌株对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要机制之一。在临床诊疗过程中，需对ICU、神经外科患者进行重点监测，做好医院感染防控措施，合理使用抗菌药物，减少CRAB的进一步传播。