2017—2021年山东日照市规模鸡场支原体净化监测分析

刘玉才，韩 勇

1.山东省日照市五莲县动物疫病预防控制中心，山东 五莲 262300；

2.山东省日照市动物疫病预防控制中心，山东日照 276800

目前，报道对禽有致病性的支原体有28 种，其中危害最严重的有3 种，即鸡毒支原体、鸡滑液支原体和火鸡支原体[1]。其中，鸡毒支原体和鸡滑液支原体的感染最为严重，直接危害我国养禽业。

鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum，MG）又称鸡败血支原体[2]，是引起鸡慢性呼吸道病的病原菌。MG 定殖鸡的呼吸道后，导致呼吸道上皮细胞纤毛活动减弱或停滞，引起鸡群继发大肠杆菌感染或鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒感染，引起严重的并发症，使鸡群死亡率增高，给养鸡业造成严重的经济损失[3]。滑液囊支原体感染又称为传染性滑膜炎、传染性滑液囊炎、滑液囊支原体感染[4]，是由禽滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae，MS）引起禽类的一种急性或慢性亚临床型疾病。MS 在鸡群中普遍存在，感染后大多呈隐性经过，但容易与禽呼肠孤病毒、禽流感病毒、新城疫病毒等病原体混合感染[5]，导致病鸡出现严重的免疫抑制、生长发育迟缓等现象，造成产蛋量、孵化率和饲料转化率降低，对养鸡业造成较大的经济损失[6]。

MG 和MS 均主要感染鸡和火鸡，MG 和MS 感染后都有呼吸道症状，且MG 有时也可导致雏鸡关节炎而出现跛行，2 种病原存在混合感染[7]，给临床确诊造成困难。MG 和MS 既可以水平传播，也可以垂直传播，给家禽养殖业带来严重的危害和经济损失。日照市家禽种业既有日照麻鸡优良地方品种，又有白羽肉鸡等引进品种。2017—2021 年选择4个种鸡场连续开展鸡支原体流行病学调查，掌握种鸡场支原体的流行状况，为净化鸡支原体提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 抽检方法

群内采用流行病学抽样方式，实验室检测考虑检测方法的敏感性，即检测到阳性动物，按照中国动物卫生与流行病学中心设计Epi Sampling Calculator 软件，以估计流行率的抽样方法进行抽样监测[8]，抽样样本量计算公式[8]为：

其中n为抽样个数，CL 为置信水平，D为群中的阳性动物数（等于群内个体数与预定流行率的乘积），N为群内个体数，Se 为检测方法的敏感性。

原种场按照置信水平95%，预期流行率0.5%，每次采样不少于200 份。祖代场按照置信水平95%，预期流行率2%，每次采样不少于100 份。父母代场按照置信水平95%，预期流行率4%，每次采样不少于60 份。样品来源于每个种鸡场不少于4 栋鸡舍的鸡只，种公鸡、开产母鸡和后备鸡要兼顾一定比例。每只鸡采集血清、鼻腔拭子、蛋清，编号一一对应。

2017—2021 年，4 个鸡场采集血清420 份、拭子420 份进行检测，样品采集情况见表1。

表1 日照市种鸡场采样情况

1.2 样品采样和处理方法

1）血清。用促凝血管采集全血2 mL，室温静置30 min 以上，待析出血清后，3 000 r/min 离心3～5 min，取出0.5 mL 血清置于1.5 mL 离心管内，并做好编号。

2）棉拭子。将1.0～1.2 mL PBS 缓冲液滴入1.5 mL 离心管，将棉签插入口腔、鼻腔内部，来回旋转3～4 下，将沾取黏液的棉棒放入离心管内，棉签头折断将离心管盖上，离心管中静置过夜，浸出液上清进行试验，采集口腔和鼻腔双拭子，将拭子放置1 个离心管内，每只鸡采集的棉拭子和血清一一对应。

1.3 检测试剂与仪器

鸡毒支原体抗体ELISA 试剂盒、鸡滑液囊支原体抗体ELISA 试剂盒购自荷兰百测公司，鸡支原体荧光PCR 试剂盒购自北京世纪元亨公司。生物安全柜购自新西兰公司，超纯水纯化系统（Cascada）购自美国PALL 公司，移液器购自Eppendorf 公司，核酸提取仪购自西安天隆公司、实时荧光PCR 仪购自美国ABI 公司、酶标仪购自美国MD 公司，离心机购自Sigma 公司。

1.4 实验室检测方法

采集的鼻腔和口腔双拭子提取病毒核酸，采用荧光定量PCR 方法，检测支原体病原。采集的血清进行MG、MS 抗体ELISA 试验，检测MG、MS 抗体阳性率。

2 结果与分析

2.1 监测总体情况

2017—2021 年，对4 个种鸡场开展连续监测，共检测血清样品420 份、拭子样品420 份。调查结果显示，经过多年的监测净化，全市鸡支原体总体感染率呈明显下降趋势，但部分祖代和父母代鸡场阳性率仍较高，仍需继续坚持净化。

2.2 不同年份鸡白痢检测情况

对2017—2021 年监测数据进行分析，2017—2021 年全市检测场（点）20 个（次），检测样品2 100份/次，鸡支原体个体阳性率和群体阳性率总体呈下降趋势（表2）。

表2 2017—2021 年鸡支原体个体、群体阳性率 %

2.3 日照麻鸡和白羽肉鸡感染情况

对全市的4 个场多年连续检测显示，日照市种鸡场支原体感染率较高，尤其日照麻鸡这一地方品种鸡支原体的群体阳性率和个体阳性率均较高，日照市净化任务依然艰巨。

3 讨 论

1）目前，国内鸡群MG、MS 感染严重，给养鸡场带来严重的经济损失。朱小甫等[9]对63 份组织样品、12 份关节样品和260 份喉头棉拭子样品进行PCR 检测，组织和喉头棉拭子样品MG 阳性率为7.8%。MS 在组织、关节和喉头棉拭子样品中均有检出，阳性率为31.3%。MG 和MS 双阳性率为17.0%。支原体除了可以水平传播外，还可以垂直传播[10-11]，其中，垂直传播方式随着种群繁育会造成病原扩散、危害扩大的继代效应。因此，从源头种禽场开展净化显得尤为重要。2017—2021 年调查结果显示，日照市1 个原种鸡场经过净化，已经检测不出鸡支原体。全市鸡支原体总体感染率呈明显下降趋势，但个别祖代和父母代鸡场阳性率仍较高，仍需继续坚持净化，净化任务依然艰巨。

养鸡场要从具有《种畜禽生产经营许可证》的种禽场引种，国外引进种禽和种蛋应符合相关规定，优先从获得农业农村部净化评估认证的种禽场引种。对引进的禽要做好抽检，由具备资质的第三方实验室出具检测报告。禽场所用种蛋、后备种鸡和引入种鸡应进行检测，确认开展净化的特定病种为阴性。对引入种鸡尤其应实行严格的隔离检测，一般在独立的隔离舍隔离40 d 以上，确保临床健康、净化病种感染阴性后，经彻底消毒方可进入生产线。

2）为了解鸡支原体感染情况，科学抽样很关键。本研究采用流行病学方式进行群内抽样，采样科学，一定程度上能反映支原体的感染状况。但由于时间紧、物力紧张等原因，仅选取了4 个种鸡场进行监测，数量相对较少，所以阳性感染率需要扩大抽样群体进行监测。另外，由于原种场阳性率较低，仅采样200份，数量相对较少，不能最大限度反映感染情况。

3）从本次的持续监测来看，日照麻鸡这一优良地方品种在日照市虽然进行了很好的保种，但鸡支原体防控措施不到位，导致日照麻鸡的感染率仍较高。另外，检测结果显示日照市白羽肉鸡支原体感染率也较高。因此，下一步要把支原体作为禽场净化的主要病种加以重视。

2015 年以来，日照市在全市大力开展种鸡场主要垂直传播疫病净化工作，制定适合的净化方案，开展鸡支原体、禽白血病、鸡白痢等垂直传播疫病净化关键技术研究。经过多年的监测净化，鸡支原体等疫病的群体阳性率和个体阳性率不断下降，净化成效明显。下一步要继续加大净化力度，推动鸡支原体从源头上得到净化。