BCL-2 家族及BH3 模拟物在结直肠癌治疗中的研究进展

姬宇潇，姚伟龙，陈淑珍，张澍田

结直肠癌是在结直肠组织中形成的一种恶性肿瘤，目前是全世界第三常见的癌症，也是癌症相关死亡的主要原因之一[1]。目前，手术和化疗是结直肠癌的两种主要治疗方案，治疗方案的选择取决于肿瘤分期和瘤体具体位置以及患者的个体特征[2]。据报道几乎所有接受化疗的结直肠癌患者都会产生耐药性，这限制了抗癌药物的治疗效果，最终导致化疗失败[3]。目前有大量临床前研究表明，BH3 模拟物可诱导凋亡并使耐药的结直肠肿瘤细胞对抗癌药物敏感，但目前尚无临床研究证实，需要大量实验验证。本文对 B 淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，BCL-2）家族及其同源结构域 BH3 的模拟物在结直肠癌治疗应用中的研究进展作一综述。

1 BCL-2 家族与结直肠癌

1.1 BCL-2 家族与细胞凋亡

在细胞凋亡过程中，BCL-2 家族成员起着至关重要的作用，它们具有较高的同源性，含有 BH1、BH2、BH3、BH4 等保守结构域，通过其功能及包含结构域的不同一般将其分为三个亚家族。第一个是多结构域抗凋亡蛋白，包括 BCL-2、BCL-XL、BCL-W、A1、BCL-B 和髓细胞白血病-1 蛋白（myeloidcell lekemia-1，MCL-1）[4]，它包含所有的 4 个 BCL-2 同源结构域，并通过拮抗其他两个促凋亡亚家族的成员促进细胞存活。第二个亚家族是多结构域促凋亡蛋白家族，共有 3 个 BH 结构域（BH1～3），包括 BCL-2 拮抗杀伤蛋白（BCL-2 antagonist killer 1，BAK）、BCL-2 相关 X 蛋白（BCL-2 associated X protein，BAX）以及 BCL-2 卵巢杀伤蛋白（BCL-2 ovarian killer，BOK），这些蛋白聚合后可以形成孔道，通过诱导线粒体外膜通透性升高进一步促进细胞凋亡。第三个亚家族是唯 BH3 促凋亡蛋白，仅具有单一的 BH3 结构域，包括BCL-2 相关死亡促进蛋白（BCL-2 associated death promoter，BAD）、BH3 交互结构域蛋白（BH3-interacting domain，BID）、BH3 交互杀伤蛋白（BH3-interacting killer，BIK）、BCL-2 交互调节蛋白（BCL-2 interacting mediator，BIM）、BCL-2 修饰因子（BCL-2 modifying factor，BMF）、自杀蛋白（Harikari，HRK）、佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酸诱导蛋白 1（phorbol-12-myriatate-13-acetate-induced protein 1，PMAIP1/NOXA）、p53 上调凋亡调节蛋白（p53 upregulated modulatar of apoptosis，PUMA）[5]。在健康细胞中，多结构域抗凋亡蛋白可以与被部分激活的 BAX 和 BAK 结合，通过抑制 BAX/BAK 聚合起到抗凋亡的作用，唯 BH3蛋白可以通过结合抗凋亡的 BCL-2 蛋白，从而游离出BAX/BAK，或通过直接激活这些凋亡效应器来启动凋亡[6]。决定细胞是倾向于生存还是死亡的最重要因素正是这些促凋亡和抗凋亡蛋白的相对浓度以及不同家族成员之间的亲和力，各种 BCL-2 家族蛋白彼此结合的特异性不同，形成了复杂但有序的激活网络，决定着细胞的命运。

1.2 BCL-2 家族与结直肠癌发生发展

在结直肠癌的发生发展过程中存在基因的变异及表观遗传学的异常。根据以往研究我们得知，BCL-2 家族蛋白随着结直肠癌疾病进展可发生差异性的表达，这在一定程度上提供了治疗的新思路。

1.2.1 正常组织和腺瘤组织中 BCL-2 家族蛋白表达 在结直肠癌进展过程中，细胞凋亡逐渐受到抑制。正常组织和腺瘤组织中 BCL-2 家族蛋白表达的免疫组织化学（IHC）分析表明，在转化过程中，BCL-2 家族各成员的表达水平存在差异性变化。IHC 数据表明，结直肠腺瘤的抗凋亡蛋白 BCL-XL 水平升高，而 BCL-W 几乎检测不到，BCL-2和 MCL-1 染色在不同的研究中显示出不一致的结果，虽然一些研究发现腺瘤中 BCL-2 蛋白水平升高，但也有报告表明，与正常组织相比，BCL-2 蛋白表达降低或无变化[7]。

1.2.2 结直肠癌组织中 BCL-2 家族蛋白表达 目前有相关研究表明，BCL-2 在结直肠癌细胞质及细胞膜均有表达，其在结直肠癌组织中表达阳性率高于正常结直肠组织及癌旁组织，表达水平与肿瘤直径及 TNM 分期有关，TNM 分期越高，BCL-2 表达水平越高[8]，但 BCL-2 表达水平与预后有无关联，目前尚无定论。研究发现，MCL-1 在正常肠道上皮组织中水平很低，但在结直肠癌组织中水平升高[9]，同时，MCL-1 的蛋白水平同结直肠癌的分级及恶性程度相关，分级越高、恶性程度越高的结直肠癌组织中 MCL-1 水平越高[10]。BCL-XL 在 38%～52% 的结直肠癌中高表达[11]，研究发现，在结直肠癌中 BCL-XL 的蛋白水平是显著上调的，这提示我们在结直肠癌中 BCL-XL 的作用非常重要[10]。癌症患者样本中的 BCL-2 表达也与癌症进展相关，这其中包括结直肠癌中的肝转移[12]。其次，癌症患者样本中 BCL-XL 的上调已被报道与结直肠癌的侵袭和转移有关[13]。

2 BH3 模拟物与结直肠癌

2.1 BH3 模拟物的靶向治疗

结直肠癌发生发展过程对 BCL-2 家族的依赖性提供了一个治疗的机会窗口，我们可以据此特异性地靶向相关癌细胞的凋亡。目前，被称为 BH3 模拟物的高度特异性小分子抑制剂已被开发出来，通过模拟唯 BH3 蛋白的作用起到抑制肿瘤组织生长的作用[7]。

2.1.1 BH3 模拟物与抗肿瘤 BH3 模拟物即唯 BH3 域蛋白小分子模拟物，能够直接结合 BCL-2 抗凋亡蛋白并拮抗其抗凋亡功能，促使与其结合的促凋亡蛋白 BAX/BAK的释放，或唯 BH3 蛋白的释放，最终激活 BAX/BAK 蛋白，从而特异、广谱、高效地诱导肿瘤细胞凋亡，达到抗肿瘤的目的。目前多应用于白血病等血液系统疾病，小细胞肺癌、乳腺癌等实体肿瘤亦可见相关临床应用。根据其靶点不同可大致分为泛靶点抑制剂、双靶点抑制剂、单靶点抑制剂。部分 BH3 模拟物实体瘤相关临床试验见表 1。

表1 BH3 模拟物临床试验

2.1.2 BH3 模拟物结直肠癌临床前作用机制研究 在结直肠癌领域 BH3 模拟物的相关研究主要包含特定模拟物分子作用机制以及细胞、动物水平临床前实验，尚无临床试验的相关数据。研究表明多靶点抑制剂 obatoclax（GX15-070）可能通过诱导人结直肠癌细胞 HCT 116 中的β-连环蛋白失稳或下调人结直肠癌细胞 Dexter-1 中的淋巴增强因子 1（lymphoid enhancer factor 1，LEF1）来抑制WNT/β-连环蛋白信号从而使 survivin 下调促发凋亡机制[14]。BCL-2/BCL-XL 双靶点抑制剂 BM-1197 的功效也在结直肠癌细胞系中进行了相关实验，它增加了细胞周期亚 G1期的细胞比例，进一步诱导凋亡，并增加了细胞核小体间的DNA 断裂[15]。TW-37 是一种新开发的小分子 BCL-2 抑制剂，其靶向多个抗凋亡 BCL-2 蛋白成员，在目前的研究中，仅使用纳摩尔浓度的 TW-37 便可抑制 HCT-116 细胞和原代人结直肠癌细胞的存活和增殖。同时，TW-37 诱导结直肠癌细胞 caspase-3/9 活化和凋亡，在小鼠体内，静脉注射TW-37 可抑制小鼠 HCT-116 肿瘤生长[16]，这表明，TW-37靶向 BCL-2 家族蛋白可能是抑制结直肠癌细胞的一种良好策略。亦有研究表明多靶点抑制剂 navitoclax 在结直肠癌治疗中与雷帕霉素靶蛋白复合物 1/2（target of rapamycin complex 1/2，TORC1/2）抑制剂起到协同作用[17]。

2.1.3 BH3 模拟物结直肠癌治疗可行性 虽然目前还没有专门的临床试验测试 BH3 模拟物的疗效，但有证据表明这些抑制剂在结直肠癌治疗中使用的可行性，在结直肠癌发生发展的所有阶段都可以观察到抗凋亡蛋白的去调节表达，这些变化可以指导使用 BH3 模拟物进行治疗。最近在一组不同细胞系中进行的一项研究发现，BCL-2 的依赖性与BCL-2 的表达水平直接相关，高表达者对 BCL-2 单靶点抑制剂 ABT-199 更加敏感[18]。BCL-2 在隐窝干细胞中的表达，在促进肠干细胞转化和腺瘤存活中发挥重要作用，这表明 BCL-2 是家族性腺瘤性息肉病等高危情况下结直肠癌化学预防的潜在靶点[19]。然而，随着病情的发展，BCL-2 的表达逐渐丧失，大多数结直肠癌细胞系对 ABT-199 不敏感[17]。考虑到在大多数结直肠癌组织中发现的高水平BCL-XL，它已经成为结直肠癌治疗的主要目标[20]。对 BCL-2抑制剂不起反应的结直肠癌干细胞对 BCL-XL 特异性抑制剂 WEHI-539 非常敏感，联合应用该药物提高了化疗的疗效[21]。泛靶点抑制剂 ABT-737 在耐药干细胞中也能诱导细胞死亡，同时结合多种化疗方案对结直肠癌体外组织和细胞系也显示出疗效[20]。一些研究表明，ABT-737 以及 ABT-263在实体肿瘤中发挥疗效主要是通过抑制 BCL-XL[22]。BCL-XL 的抑制效果与 MCL-1 的活性密切相关，同时使用MCL-1 抑制剂可能增强 BCL-XL 抑制的作用[23]。综上所述，这些临床前数据表明联合应用 BH3 模拟物针对多靶点进行靶向治疗在结直肠癌治疗中有很大的前景，表达BCL-2 的早期高危腺瘤可以通过 ABT-199 抑制 BCL-2，从而防止肿瘤进展。另一方面，使用 BCL-XL 特异性抑制剂联合 MCL-1 抑制治疗晚期癌症可能更有效。临床实践中使用 BCL-XL 抑制剂的主要问题是使用后引发的血小板减少，因为 BCL-XL 具有调节血小板的作用[24]，这个问题可以通过与其他化疗药物协同联合来解决，这在一定程度上还可以降低药物的使用剂量[25]。这些临床前研究推动了 BH3模拟物在结直肠癌治疗中的应用进程。

2.2 BH3 模拟物与联合用药

在靶向治疗过程中，癌细胞有可能改变对靶点通路的依赖性。如果不同时抑制替代途径，就会迅速产生耐药性。例如在慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）的相关研究中发现，虽然最初癌细胞对 navitoclax 敏感，但后期 BCL-XL 和 A1 的上调和过度表达使 CLL 细胞对 navitoclax 的耐药性提高了 1000 倍[26]。在临床前模型中，同时抑制 MCL-1 和 BCL-2 已被反复证明可以增强诱导凋亡的效果，这表明同时抑制这两个靶点可以起到协同作用[27]。无论是同时使用多种 BCL-2 家族抑制剂还是BCL-2 家族抑制剂与标准抗癌药物相结合的联合疗法，在许多情况下都显示出确实明显的疗效。但我们尚没有明确能够将毒性降至最低的同时使联合药物协同作用达到最高的剂量标准和药物组合。除了调节细胞凋亡，BCL-2 家族蛋白似乎扮演了更多的角色，BCL-XL 已被证明是血小板存活的关键因子[28]，另一方面，BCL-2 是粒细胞生成以及调节免疫系统反应的重要因素[22]，用药所带来的毒副作用难以忽视。目前已经有动物实验观察到 BH3 抑制剂对小鼠心肌细胞的毒性作用以及血小板的抑制作用[29]。MCL-1 和BCL-XL 在小鼠模型中联合应用引起的急性肝损伤是致命的，但是谨慎的用药剂量和给药时机仍有可能建立一个治疗窗口[30]。联合用药存在大量潜在的排列组合，特别是在同时或顺序使用超过 2 种药物的情况下，如何安全获得更多的效益，我们知之甚少。多药联用在实现预期结果的同时会带来一系列的毒副作用，需要利用 I 期联合治疗实验数据谨慎评估。

2.3 BH3 模拟物及 BH3 图谱

BH3 图谱是一种用来评估细胞发生凋亡的倾向以及细胞对不同抗凋亡蛋白（BCL-2 家族，如 BCL-2、BCL-XL、BCL-W）相对依赖性的功能分析方法[31]。BH3 图谱在分析各种血液系统恶性肿瘤中 BCL-2 蛋白的相互作用已有相关研究，并为 venetoclax 等在血液疾病的应用提供了理论基础[31]。虽然我们已经开始了解不同 BCL-2 家族成员在一系列恶性肿瘤细胞系中的不同表达模式，但仍然很难预测哪些患者和哪些结直肠癌类型可能对特定的药物或药物组合产生反应，如何识别肿瘤持续增殖所必需的促生存蛋白，以及面对诸多潜在的治疗方式，医生如何才能在它们之间做出最佳选择，以满足特定患者或某类患者的需要。BH3 图谱结合各种 BCL-2 家族抑制剂，提供了一个解决此类问题的可能性[32]。BH3 图谱虽然尚未广泛应用于临床，但是在预测对 BH3 类似物的耐药性或应答方面有一定的实用价值[22]。目前，对治疗反应的预测还比较困难，但如果 BH3 图谱成为治疗的标准，便可以基于患者的个体 BH3 图谱，选择合适的 BCL-2 家族抑制剂及其组合，并计算出可诱导的最大效应和最小毒性[33]。由于有一些 BCL-2 家族成员可以在翻译后被调控，我们所面对的挑战不仅需要预测细胞中不同 BCL-2 家族成员的种类及含量，还需要测量不同 BCL-2家族成员的分子状态（活性），以预测对 BH3 模拟药物的敏感性。所谓的“动态 BH3 图谱”正是为了测量药物诱导的早期促凋亡信号的变化，明确肿瘤细胞中抗凋亡 BCL-2家族成员的依赖性而提出的策略之一[32]。

3 总结及展望

目前 BH3 模拟物在结直肠癌治疗的临床前研究上显示出极大的可能性，但仍存在许多问题和挑战。目前临床上应用的 BH3 模拟物诱导细胞凋亡的具体机制有待解开。将两种甚至更多的 BH3 模拟物联合起来，同时或按顺序依次抑制几种有利于生存的 BCL-2 蛋白，可能是一种很有吸引力的结直肠癌治疗方法。但是，仅仅基于蛋白质组数据往往很难预测特定抑制剂组合的有效性，而且为了保证治疗的有效性，需要预测联合治疗在体内各种组织中的效果。当务之急是合理设计药物组合和发现预测性生物标记物，以识别最有可能在 BH3 模拟物的治疗中受益的患者。当然，随着当前实验的成熟和更多数据的获得，我们完全有理由对这一充满希望的结直肠癌治疗方法的未来持乐观态度。