多重PCR 技术检测儿童呼吸道病原的结果分析及临床应用价值评估

袁青，史大伟，窦海伟，辛德莉

儿童急性呼吸道感染（acute respiratory tract infections，ARTIs）发病率高，是儿童常见的呼吸系统疾病。儿童呼吸道感染常见病原主要为细菌、病毒、非典型病原体，大部分感染是由病毒及非典型病原体引起[1]。明确感染病原有助于抗微生物药物的合理使用及呼吸道传染病的早发现、早隔离、早报告、早治疗。因此，多病原检测对于儿童急性呼吸道感染的诊断和治疗非常重要[2]。本研究采用多重 PCR 技术对儿童 ARTIs 患者的咽拭子和支气管肺泡灌洗液（BALF）进行检测，了解儿童急性呼吸道感染病原分布情况，并评估多重 PCR 技术在诊断中的价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取 2018 年 1 月 -2019 年 1 月北京地区多家医院（首都医科大学附属北京友谊医院、北京大学第一医院、首都医科大学附属北京朝阳医院、北京民航总医院、煤炭总医院、北京市昌平中西医结合医院）因呼吸道感染就诊的患儿咽拭子及BALF；入选标准：①年龄 6 月～14 岁；②发热伴咳嗽或咽痛等呼吸道感染症状，病程在 1～7 d的门诊和住院病人；③血常规白细胞总数（4.0～12.0）× 109/L；诊断标准参考《诸福棠实用儿科学》第八版[3]。

1.2 方法

1.2.1 咽拭子及 BALF 标本采集 咽拭子标本用尼龙材质植绒拭子采集，采集后置于装转运培养基的采样管中，BALF 标本按照电子支气管镜操作规范留取[4]，分装后于 -80 ℃ 冰箱中保存。

1.2.2 核酸提取 核酸提取采用康为世纪生物科技有限公司的通用基因组 DNA 提取试剂盒（批号20321），具体操作按照试剂盒说明书要求进行。

1.2.3 13 种呼吸道病原多重 PCR 检测 应用13 种呼吸道病原多重检测试剂盒（宁波海尔施基因科技有限公司，批号：109103001）进行 PCR 扩增，操作过程按说明书进行，将PCR 产物送至宁波海尔施基因科技有限公司进行毛细电泳片段分离。检测的病原包括甲型流感病毒（InfA）、甲型流感病毒 H1N1（2009）（InfA-H1N1）、季节性流感病毒（InfA-H3N2）、乙型流感病毒（InfB）、副流感病毒（HPIV）、人腺病毒（HAdV）、博卡病毒（HBoV）、人鼻病毒（HRV）、肺炎衣原体（CP）、肺炎支原体（MP）、人偏肺病毒（HMPV）、冠状病毒（HCoV）和人呼吸道合胞病毒（RSV）。

1.2.4 荧光定量 PCR 法检测 MP 参照文献[5]扩增 23S rRNA 基因，上游引物序列 5' GACAC CCGTTAGGCGCAA 3'，下游引物序列 5' CTGGA TAACAGTTACCAATTAGAACAGC 3'，目的片段长度为 186 bp，总反应体系 20 μl，模板 2 μl，反应条件：95 ℃ 2 min，× 1 循环，95 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 1 min，× 40 循环。

1.3 统计学处理

采用 SPSS20.0 软件进行统计学分析。计数资料采用χ2检验，一致性分析采用 Kappa 检验。P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

共收集到 ARTIs 患儿呼吸道标本 268 例，其中咽拭子 158 例，BALF 110 例；男 125 例，女 143 例；＜ 3 岁组 44 例，3～6 岁组 93 例，≥ 6 岁组 131 例。

2.2 多重 PCR 病原检测结果

268 例呼吸道标本中，231 例（86.19%）检出至少一种以上的病原，51 例（19.03%）检出两种或两种以上病原。MP 和流感病毒占所检病原的前两位，检出的病原按例数分别为 MP 109 例（40.67%），H1N1 43 例（16.04%），InfA 36 例（13.43%），RSV 29 例（10.82%），H3N2 14 例（5.22%）、HRV 14 例（5.22%），HMPV 13 例（4.85%），InfB 10 例（3.73%），HAdV 9 例（3.36%），HCoV 6 例（2.24%），HPIV 5 例（1.87%），HBoV 1 例（0.37%），CP 1 例（0.37%）。158 例咽拭子标本，阳性检出率为 84.81%（134/158）。44 例检出两种或两种以上病原（27.85%），流感病毒占第一位，其次为 RSV、MP，未检测到 HBoV及 CP；110 例支气管肺泡灌洗液标本，阳性检出率为 88.18%（97/110），7 例检出两种或两种以上病原（6.36%），MP 检出率最高，未检测到 InfA、H3N2、InfB（表 1 和表 2）。

表1 不同标本来源 ARTIs 患儿病原分布情况[n（%）]Table 1 Distribution of pathogens in children with ARTIs from different specimen sources [n (%)]

不同标本来源的病原阳性检测结果显示，咽拭子和支气管肺泡灌洗液标本阳性检出率分别为84.81%、88.18%，组间差异无统计学意义（χ2=0.620，P=0.431）。咽拭子标本组的 2 种病原检出率明显高于 BALF 组，组间差异有统计学意义（χ2=19.427，P＜ 0.001）（表 2）。

表2 不同标本来源 ARTIs 患儿病原检出情况[n（%）]Table 2 Pathogen detection in children with ARTIs from different specimen sources [n (%)]

0～3 岁组 44 例呼吸道标本中，36 例（81.82%）检出至少一种以上的病原，8 例（18.18%）检出两种或两种以上病原，RSV 检出率最高，其次为流感病毒。3～6 岁组 93 例呼吸道标本中，79 例（84.95%）检出至少一种以上病原，25 例（26.88%）检出两种或两种以上病原，流感病毒检出率最高，其次是 MP。≥ 6 岁组 131 例呼吸道标本中，116 例（88.55%）检出至少一种以上的病原，18 例（13.74%）检出两种或两种以上病原，MP 检出率最高，其次为流感病毒。不同年龄组病原检测结果显示，各组病原阳性检出率分别为 81.82%、84.95% 和 88.55%，组间差异无统计学意义（χ2=1.441，P=0.487）。3～6 岁组中两种及以上病原检出率明显高于 ≥ 6 岁组，差异有统计学意义（χ2=6.055，P=0.014），而 0～3 岁与3～6 岁组（χ2=1.236，P=0.266）、≥ 6 岁组（χ2=0.514，P=0.474）比较，差异均无统计学意义（表 3）。流感病毒感染可见于各年龄段患儿，RSV 感染主要见于婴幼儿，MP 感染见于学龄前和学龄期儿童，不同的是学龄前儿童以流感病毒感染为主，学龄期儿童以 MP 感染为主（表 4）。

表3 各年龄组 ARTIs 患儿病原检出情况[n（%）]Table 3 Detection of pathogens in children with ARTIs in each age group [n (%)]

表4 各年龄组 ARTIs 患儿病原分布情况[n（%）]Table 4 Pathogen distribution of children with ARTIs in different age groups [n (%)]

2.3 多重 PCR 法和荧光定量 PCR 法 MP 检测结果比较分析

268 例呼吸道标本，荧光定量 PCR 法检测出MP 阳性标本 123 例（45.90%）。＜ 6 岁组中 MP阳性标本 31 例（22.63%），≥ 6 岁组中 MP 阳性标本 92 例（70.23%），两个年龄组 MP 阳性检出率比较，≥ 6 岁组明显高于 ＜ 6 岁组，差异有统计学意义（P＜ 0.001）。分析比较两种方法 MP 检测结果，多重 PCR 检出 MP 阳性者 109 例（40.67%），阴性者 159 例（59.33%），荧光定量PCR 检出 MP 阳性者 123 例（45.90%），阴性者145 例（54.10%），两种方法具有高度的一致性（Kappa=0.879，P＜ 0.01），总符合率为 94.03%，其检出 MP 阳性率相似，差异无统计学意义（P=0.262）。以荧光定量 PCR 法为标准评价多重 PCR检测的诊断价值（表 5），其敏感性为 87.80%，特异性为 99.31%，漏诊率为 12.20%，误诊率为0.69%，阳性预测值为 99.08%，阴性预测值为90.57%，阳性似然比为 136.28，阴性似然比 0.06，约登指数为 0.871，受试者工作特征曲线（ROC）下面积 0.943（图 1）。

图1 多重 PCR 法受试者工作特征曲线Figure 1 Receiver operating characteristic curve of multiplex PCR

表5 多重 PCR 和荧光定量 PCR 法检测 MP 的一致性比较（n）Table 5 Consistency comparison of MP detection by multiplex PCR and fluorescence quantitative PCR (n)

3 讨论

儿童呼吸道感染是儿童常见病和多发病，病毒和非典型病原是儿童呼吸道感染的常见病原[6]。近年来临床医生越来越重视儿童呼吸道病毒感染的检测，在呼吸道感染急性期需明确诊断细菌感染或病毒感染，可避免抗生素的过度使用，对预防及治疗儿童呼吸道感染具有重要的临床意义。

目前儿童呼吸道感染病原体检测方法主要有分离培养法、血清学抗体检测、抗原检测、分子生物学检测等[7]。分离培养是病原体诊断的金标准，但其操作繁琐、耗时长，阳性检出率偏低，有些微生物（如支原体、衣原体和病毒）体外培养成功率偏低，临床应用价值有限。血清学抗体检测存在相应的窗口期，受机体抗体产生能力的影响，单份血清结果的参考意义有限，临床双份血清的 2 次采血需间隔 2 周，采集率较低，无法满足临床快速诊断的需求，对病原体早期诊断意义不大。抗原检测虽然用时短，操作简便，特异性高，但敏感性偏低，容易漏诊。分子生物学检测与传统检测方法相比，敏感性高、特异性好，对于病原菌的早期临床诊断有重要作用。由于受检验方法的限制，以往儿童急性呼吸道感染的病原学诊断多局限于单一病原的检测，但随着病原学诊断方法的改进和创新，多重病原体混合感染的报道也在逐年增多[8]。多重PCR 方法能同时检测多种病原体，在临床混合感染的鉴别诊断上具有独特的优势和较高的实用价值[9]。

本研究检测结果显示，268 例呼吸道标本，采用多重 PCR 技术有 231 例标本检出至少一种以上的病原，阳性检出率为 86.19%，说明多重 PCR技术的核酸检测具有较高的阳性检测率；其中51 例（19.03%）检出两种或两种以上病原，与张海邻等[10]应用多重 PCR 技术检测对温州地区5 岁以下儿童呼吸道感染标本约 22.6% 的标本中检测到两种或两种以上病原的报道相近，提示儿童呼吸道感染中混合感染的情况并不少见；在单一病原感染中，MP 和流感病毒检出率较高，提示 MP和流感病毒是本地区儿童呼吸道感染的主要病原体[11]。不同部位的标本，病原检出情况也不尽相同，咽拭子标本病毒检出率最高，以流感病毒和 RSV为主；BALF 标本中检出以 MP 为主，提示重症肺炎。在不同年龄组的比较中，0～3 岁组 RSV 检出率最高，其次为流感病毒；3～6 岁组流感病毒检出率最高，其次是 MP；≥ 6 岁年龄中，MP 的检出率最高，其次为流感病毒；提示 RSV 及流感病毒是婴幼儿呼吸道感染的常见病原，MP 是学龄儿童呼吸道感染的常见病原。

多重 PCR 技术是在一个反应管内加入多对引物，在短时间内一份标本可同时检测多种病原体，有助于发现混合感染实现对呼吸道病毒早期、快速、准确诊断[12]。采用多重 RT-PCR 与毛细管电泳联用技术对 13 种呼吸道病原体的检测靶点和3 个内参靶点进行特异性的 RT-PCR 扩增，并采用毛细电泳分离不同长度的 RNA 或 DNA 片段，得到病原体检测结果，增加了检测的灵敏度，提高样本使用率。通过多种病原体的同时检出，并准确区分流感病毒不同亚型（InfA、InfA-H1N1、InfA-H3N2、InfB 及 HPIV）的种类，降低了检测的成本，减轻患儿的经济负担。本研究同时应用荧光定量 PCR法和多重 PCR 法检测 MP，两种方法检测 MP 阳性率和各年龄组比较差异均无统计学意义，一致性分析显示两种方法具有高度的一致性（Kappa=0.879，P＜ 0.01），总符合率为 94.03%，提示多重PCR 技术对 MP 的检测有很好的准确性。

综上所述，MP 及流感病毒是北京地区儿童呼吸道感染的重要病原，而且混合感染的情况并不少见。多重 PCR 技术具有高通量检测的优势，可快速、高效筛查多种呼吸道病原体，在临床多重感染的诊断上具有独特的优势和较高的实用价值。