黑木耳的性状特征和膨胀度与麦角甾醇含量相关性研究

曾敏芳，包海鹰※，宋超，赵卉，毕融冰

（1.吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118；2.中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112）

黑木耳是担子菌门Basidiomycota 蘑菇纲Agaricomycetes 木耳目Auriculariales 木耳科Auriculariaceae、木耳属Auricularia 黑木耳Auricularia heimuer F.Wu et al 的子实体，性平，味甘；归胃、大肠经；具有滋阴润肺、养胃润肠和血止血的功效，主治虚劳咳嗽、痰中带血、胃肠燥热、口干便秘、血瘀积聚、月经不调和崩漏便血等[1]。黑木耳又名木耳、木蛾、木菌、树鸡、云耳、耳子、黑菜、细木耳和光木耳等，是我国传统的药食同源胶质真菌[2,3]。

麦角甾醇（ergosterol）又称麦角固醇，是真菌类的特征甾醇，能促进人体对钙、磷的吸收，是人体外源性维生素D2的良好来源之一[4]，常被用以改善婴幼儿及高龄人群缺乏维生素D 而导致的佝偻病、软骨病和骨质疏松症[5]。同时本实验室通过研究发现从蒙古口蘑中提取的麦角甾醇具有显著的抗肿瘤活性[6]，此外麦角甾醇还具有增强人体免疫力、抗炎镇痛[7]、抗血小板聚集[8]、降低胆固醇[9]、抗纤维化、抗氧化和延缓衰老等多种药理作用[10,11]。目前麦角甾醇已经成为评价食药用菌的质量评价指标之一[12]。

黑木耳不仅是百姓餐桌上的常见食用菌，而且还应用于中药制剂如产复康颗粒、骨疏康颗粒、骨疏康胶囊和妙济丸中[12]，但黑木耳质量标准中未有活性成分指标的评价，更多的是将黑木耳视为食品对其总糖、粗蛋白和粗纤维等营养成分进行质量评价[13]，忽视了其药用价值。为推动黑木耳产业的可持续发展，多种成分和生物活性评价黑木耳势在必行。本研究拟将麦角甾醇作为黑木耳质量评价指标之一，目前麦角甾醇最常用的检测方法主要参考地方标准DB44/T1991-2017 灵芝及其相关产品中麦角甾醇测定的高效液相色谱法[14,15]，关于超高效液相色谱法（UPLC）测定黑木耳麦角甾醇暂未见相关研究，因此本研究拟建立快速分析黑木耳中麦角甾醇含量的超高效液相色谱法，同时分析黑木耳麦角甾醇含量是否与性状特征和膨胀度相关，为该药材的质量评价提供科学依据。

1 实验材料

1.1 实验样品

从全国不同省份的市场随机购买46 批黑木耳样品，经吉林农业大学包海鹰教授鉴定均为黑木耳Auricularia heimuer F.Wu et al 的子实体。黑木耳市场价格差额大，在78～505 元/kg 之间，本次实验将黑木耳价格分为8 个等级，一级在80 元/kg 以内，此后每一级加40 元，直至大于320 元/kg 的定义为8 级。具体信息见表1。

表1 黑木耳来源信息Table 1 The source information of Auricularia heimuer

1.2 实验仪器

游标卡尺[香港杭泰（国际）集团有限公司]，膨胀度测定管，ST07B 型高速万能粉碎机（上海树立仪器仪表有限公司），ACQUITY 型超高效液相色谱仪（沃特世公司），Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（100 mm 2.1 mm，1.7m），MS204S 型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]，KS-700XDS 型超声仪（昆山洁力美超声仪器有限公司），HC-3018 型高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司），MX-S 型涡旋混匀器[大龙兴创实验仪器（北京）有限公司]，Milli-Q Advantage 型超纯水器（密理博公司）。

1.3 标准品与试剂

麦角甾醇标准品（HPLC≥98%，上海源叶生物科技有限公司，批号：J03D10R104657），无水甲醇（色谱纯，默克股份两合公司，批号：I1126907-101），乙腈[色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司，批号：F21LAL202]，超纯水。

2 方法

2.1 黑木耳性状观察

采用中药鉴定方法中的性状鉴定方法对46 份实验样品进行性状观察，并记录黑木耳干品的外观特征。同时每份样品用游标卡尺测量10 个黑木耳的长度和宽度，之后再将样品放烧杯中加清水浸泡5 h 以上直至完全泡发，用游标卡尺测量泡发后的黑木耳的长度，宽度与中间的厚度，泡发前和泡发后的样品分别拍照记录。

2.2 黑木耳膨胀度测定

先在膨胀度测定管中加入5 mL 水，再加入0.2 g（精确至0.000 1 g）粉碎过100 目筛的黑木耳粉末，用玻璃棒搅拌将粉末与水混合均匀，少量多次地加水，使黑木耳粉末充分被水浸润沉于测定管底部，并除去气泡，最后定容至25 mL 膨胀度测定管刻度线，密塞，静置。开始1 h 内每30 min 用玻璃棒充分搅拌1 次，然后静置4 h，读取黑木耳粉末膨胀后的体积（mL），再静置1h，如上读数，至连续两次读数的差异不超过0.1mL为止。最后一次读取的数值按公式S=V/W 计算，准确至0.1，其中S为膨胀度，V为样品膨胀后的体积（mL），W 为黑木耳的重量（g）。

2.3 麦角甾醇含量的测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm 2.1 mm，1.7m）；柱温35 ℃，检测波长282 nm，流动相：乙腈：水（98:2）；流速0.5 mL/min；进样量2L；运行时间5 min。

2.3.2 标准品溶液的制备 精密称取20 mg（精确至0.000 01 g）麦角甾醇标品于50 mL 容量瓶中，用无水甲醇配制成0.4 mg/mL 标准品储备液溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备 精密称取0.5 g 粉碎（精确至0.000 1 g）过100 目筛的黑木耳粉末于50 mL离心管中，按照不同料液比1:10（g/mL）、1:20（g/mL）、1:50（g/mL）添加无水甲醇，再根据不同超声时间（30min，60 min）进行提取，7 000 r/min 离心6 min，过滤，将上清液用无水甲醇定容至25 mL。提取液经0.22m 微孔有机相滤膜进行UPLC 测定。根据峰面积确定提取效率。最后根据最佳提取条件对实验样品进行提取。

2.3.4 专属性考察实验 分别将麦角甾醇标准品、供试品溶液和提取溶剂无水甲醇经0.22m 微孔有机相滤膜过滤后按2.3.1 色谱条件进行测定分析。

2.3.5 线性考察 将0.4 mg/mL麦角甾醇储备液用无水甲醇稀释成0.08 mg/mL、0.04 mg/mL、0.02 mg/mL、0.008 mg/mL、0.004 mg/mL 和0.001 6 mg/mL 一系列标准品溶液。按2.3.1 色谱条件分别进样分析，测定峰面积，以麦角甾醇质量浓度（X，mg/mL）对色谱峰峰面积（Y）绘制标准曲线。

2.3.6 精密度实验 取浓度为0.02 mg/mL 标准品溶液按2.3.1 色谱条件连续进样6 次，测定保留时间和峰面积。

2.3.7 重复性实验 精密称取6 份46 号样品0.5 g（精确至0.000 1 g），按照2.3.3 最佳实验方法制备供试品溶液并按照2.3.1 色谱条件测定6 份样品中麦角甾醇的含量和保留时间。

2.3.8 稳定性实验 取制备好的1 号黑木耳供试品溶液，按照2.3.1 色谱条件分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h和24 h 进行含量测定。

2.3.9 加标回收实验 加入相当于已知1 号样品含量80%，100%和120%的浓度为0.4 mg/mL 的麦角甾醇标准品，制备供试品溶液，按照2.3.1 色谱条件测定麦角甾醇含量，计算回收率和RSD 值。

2.3.10 样品含量的测定 将所有黑木耳样品按照2.3.3 项下最佳实验方法制备供试品溶液，按2.3.1 色谱条件测定样品麦角甾醇含量。

2.4 麦角甾醇含量与性状特征和膨胀度相关性分析

使用SPSS 22.0 将黑木耳麦角甾醇含量与泡发后的厚度以及膨胀度进行Pearson 相关性分析。

3 结果

3.1 性状特征和膨胀度

46 份黑木耳干燥子实体呈不规则的块片状，长13.62～35.10 mm，宽8.75～26.35 mm，多皱缩，表面平滑，正面多呈黑色，部分为红褐色，黑褐色或黄褐色，背面大多为黄灰色，少数呈黑灰色、灰色或灰白色，质脆易折断。加水浸泡后则膨胀，形似耳状或不规则形，边缘全缘，呈黑褐色，红褐色或棕褐色，柔润而微透明，长26.63～72.09mm，宽22.13～58.64mm，厚0.55～1.67mm。因Y44 号样品特殊的包装技术，因此无法测该样品干燥子实体的长度和宽度。黑木耳的膨胀度大小在15.0～42.3 之间，具体结果见图1、图2、图3、表2和表10。

图1 样品Y1-Y16 性状特征Fig.1 Characteristics of sample Y1-Y16

图2 样品Y17-Y32 性状特征Fig.2 Characteristics of sample Y1-Y16

图3 样品Y33-Y46 性状特征Fig.3 Characteristics of sample Y33-Y46

表2 黑木耳干燥品性状特征Table 2 Characteristics of dried Auricularia heimuer

续表

3.2 麦角甾醇含量的测定

3.2.1 色谱条件 将本次实验UPLC 色谱条件和结果与地方标准DB44/T 1991-2017 进行相关比较，见表3。结果表明在同样灵敏度高，稳定性好，准确度高的条件下，UPLC 法分析更快，出峰快且效果好，运行时间短，在样本量大的情况下，能节省更多的时间。

表3 HPLC 与UPLC 比较结果Table 3 Comparison of HPLC and UPLC results

3.2.2 供试品溶液的制备 实验样品不同提取条件结果如表4如示，结果表明最好的提取条件是精密称取0.5 g 粉末（精确至0.000 1 g）过100 目筛的黑木耳粉末于50 mL离心管中，加25 mL无水甲醇，涡旋混匀，超声提取1 h，7 000 r/min 离心6 min，过滤，将上清液用无水甲醇定容至25 mL。提取液经0.22m 微孔有机相滤膜进行UPLC 测定。

表4 不同提取条件黑木耳麦角甾醇含量提取结果Table 4 Extraction results of Auricularia heimuer ergosterol content under different extraction conditions

3.2.3 专属性考察结果 专属性考察结果见色谱图4、图5和图6。结果表明麦角甾醇标准品和供试品麦角甾醇峰的保留时间和UV光谱图一致，且无水甲醇溶剂在相应保留时间内没有峰出现，说明该方法专属性良好。

图4 麦角甾醇标准品色谱图Fig.4 Chromatogram of ergosterol standard

图5 供试品色谱图Fig.5 Chromatogram of sample

图6 无水甲醇色谱图Fig.6 Chromatogram of methanol

3.2.4 线性考察结果 线性考察结果见表5，可得标准曲线回归方程为y=5514333.6315x+820.384（R2=0.9999），说明麦角甾醇在0.001 6～0.08mg/mL范围内呈良好的线性关系。

表5 线性关系考察试验结果（n=6）Table 5 Linear relationship examination results (n=6)

3.2.5 精密度实验结果 精密度实验结果见表6。可得麦角甾醇的保留时间的RSD值为0.18%，峰面积的RSD 值为0.20%，说明仪器精密度良好。

表6 精密度试验结果（n=6）Table 6 Precision test results (n=6)

3.2.6 重复性实验结果 重复性实验结果见表7。结果表明6 份46 号样品保留时间的RSD 值为0.41%，麦角甾醇含量的RSD值为0.53%，表明方法重复性良好。

表7 重复性试验结果（n=6）Table 7 Repeatability test results (n=6)

3.2.7 稳定性实验结果 稳定性实验结果见表8。可得该样品的平均麦角甾醇含量为0.656 3 mg/g，RSD为0.23%，表明样品在24 h 内基本稳定。

表8 样品稳定性试验结果（n=6）Table 8 Sample stability test results (n=6)

3.2.8 加标回收实验结果 加标回收实验结果见表9。可得加标样品的平均回收率为100.84%，RSD 值为0.55%，说明方法准确性良好。

表9 加标回收率试验结果（n=6）Table 9 Spiked recovery test results (n=6)

3.2.9 麦角甾醇含量结果 46 份黑木耳麦角甾醇含量结果见表10。采用SPSS22.0 对测得的麦角甾醇数据结果进行单因素方差分析，从测定结果（表10）可以看出市售46 份黑木耳麦角甾醇含量在0.1359～0.8936mg/g之间，含量差异显著（P＜0.01），平均含量为0.6075mg/g，大于平均水平的有25 份。

表10 黑木耳的性状特征和膨胀度及麦角甾醇的含量Table 10 Characteristics,turgidity and ergosterol content of Auricularia heimue

3.3 黑木耳麦角甾醇含量与性状特征和膨胀度相关性分析

在日常生活中，大家普遍认为泡发性高的，厚度大的以及泡发后状似小碗的是好木耳，因此使用SPSS 22.0 将黑木耳麦角甾醇含量与泡发后的厚度以及膨胀度进行Pearson 相关性分析，结果见表11，黑木耳的麦角甾醇含量与其厚度和膨胀度分别存在极显著正相关关系（P＜0.01）。

表11 麦角甾醇与性状特征和膨胀度Pearson 相关性分析Table 11 Pearson correlation Analysis of Ergosterol with traits and swelling degree

3.4 黑木耳麦角甾醇含量与价位和产地相关性分析

目前市场上黑木耳价格差异大，结合表1和表11可以看出麦角甾醇含量最高的Y20（0.893 6 mg/g），价格为87.6 元/kg，但价格最贵的Y9（509.2 元/kg），含量为0.537 3 mg/g，含量差异显著（P＜0.01），说明黑木耳市场定价存在很大的自由度；不同价位的黑木耳的麦角甾醇含量差异明显（P＜0.01），但是不成线性关系，例如从含量来看，是Y36＜Y9＜Y16，但是从价位等级来看是Y16＜Y36＜Y9；同价位的不同产地黑木耳麦角甾醇含量差异显著（P＜0.01），例如Y2，Y5，Y6，Y13 和Y31；同价位同省份同县区的黑木耳麦角甾醇含量差异显著（P＜0.01），例如Y16 和Y17；同时也有不同价位不同产地的黑木耳麦角甾醇含量无差异性，例如Y8，Y14，Y19，Y23，Y34，说明黑木耳麦角甾醇含量与产地无特殊联系。

4 结论

目前市场上黑木耳质量参差不齐，麦角甾醇含量差异显著，且麦角甾醇含量与厚度和膨胀度分别存在极显著正相关关系（P＜0.01）。但是黑木耳麦角甾醇含量与产地和价格等因素无关。同时本研究建立了黑木耳中麦角甾醇含量测定的超高效液相色谱法（UPLC），色谱条件是使用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm 2.1 mm，1.7m），柱温35 ℃，进样量2L，检测波长282 nm，流动相为乙腈：水（98:2），流速0.5 mL/min，与常用的高效液相色谱法相比，该方法检测更快速，出峰快，运行时间短，灵敏度高，准确度高，具有很好的稳定性和重复性。本文为将黑木耳中麦角甾醇含量作为评价指标对其进行质量评价提供了参考，为进一步研究、生产和应用黑木耳作为功能性食品和治疗剂提供了研究基础。