黄连生物碱对HEK293-OATP1B3细胞转运黄芩黄酮活性的影响

梁 燕，崔馨戈，訾苗苗，汪 杰，刘 艳，王 茜,2,3,4，彭 灿,2,3,4

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；2.中药复方安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012；3. 药物制剂技术与应用安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012；4. 安徽省中医药研究院中药资源保护与开发研究所，安徽 合肥 230012)

在药物代谢与转运过程中，药物转运体发挥着不可替代的作用，药物转运体的功能可以被药物改变。OATP1B3隶属于摄取型阴离子转运多肽(organic anion transporting polypeptides，OATPs)家族，其特异性表达在肝脏基底膜，在药物体内吸收、分布、排泄、相互作用中具有重要作用。临床上，有很多药物和内源性物质均为OATP1B3的底物，如他汀类药物[1-2]、利福平[3]、替米沙坦[4]、八肽胆囊收缩素[5]，同时利福平也为OATP1B3的抑制剂。黄芩-黄连药对是临床上常用的组方，2020年版《中华人民共和国药典》记载已有50多种方剂中伍用黄连-黄芩，两者合用具有广泛的药理作用[6-7]，并且在抗炎、治疗高血糖等方面协同发挥治疗作用。研究表明，黄芩黄酮类主要成分黄芩苷和汉黄芩苷为OATP1B3的底物[8-9]，黄连中主要成分小檗碱亦为其底物[10]，黄芩苷、汉黄芩苷与小檗碱之间可能存在OATP1B3转运体底物的相互作用。同时，黄连可引起黄芩苷、汉黄芩苷的体内药物动力学特征改变[11-12]。由此推测，黄连使黄芩黄酮体内药物动力学特征改变的机制是由于黄连中主要成分引起OATP1B3对黄芩主要成分黄芩苷和汉黄芩苷的转运功能改变。因此，本实验从OATP1B3转运体角度，验证黄连生物碱对OATP1B3介导的黄芩苷、汉黄芩苷转运的影响，旨在为黄芩黄酮的肝脏转运过程机制研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1290 Infinity超高效液相色谱仪：美国Agilent公司；AB SCIEX 4500三重四极杆串联质谱仪：美国ABSCIEX公司；旋转蒸发仪：德国heidolph公司；超声波清洗仪：常丰市万丰仪器制造有限公司；BT25S型电子分析天平：德国赛多利斯科学仪器有限公司；涡旋混匀机、减压干燥箱：上海越众仪器设备有限公司；-80 ℃冰箱：日本Sanyo/合肥美菱公司；Centrifuge 5430R 4 ℃离心机：上海迪图生物科技有限公司；Bioprep-24生物样品均质仪：杭州奥盛仪器有限公司；垂直电泳系统：伯乐生命医学产品(上海)有限公司。

1.2 材料及试药 黄芩苷(批号 P20A9F59353)、汉黄芩苷(批号 R31M9F62605)、利胆酚(批号 J10M8Y35798)、小檗碱(批号 P02A7F12369)、盐酸巴马汀(批号 Z16J10X79792)、药根碱 (批号 P01A9F67139)、黄连碱(批号 Z22A10X94861)：上海源叶科技有限公司；黄连药材(批号 180919)：苏州市天灵中药饮片有限公司；黄芩药材(批号 180710)：南通三越中药饮片有限公司；DMEM培养基、胎牛血清、双抗、胰酶、T25培养瓶：Gibco；HBSS缓冲液：索莱宝；甲酸、乙腈、甲醇(LC/MS级)：赛默飞世尔科技(中国)有限公司；超纯水：由安徽中医药大学实验室Millipore超纯水系统生成。

1.3 细胞株 HEK293-OATP1B3细胞购自上海吉凯基因有限公司。

2 方法

2.1 主要工作液的配制

2.1.1 细胞用储备液的配制 精密称定黄芩苷、汉黄芩苷适量，加入二甲基亚砜溶解，配制成浓度为50 mmol/L的母液，于-20 ℃冰箱保存备用。精密称定小檗碱、药根碱、盐酸巴马汀、黄连碱适量，加入二甲基亚砜溶解，配制终浓度为30 mmol/L的母液，于-20 ℃冰箱保存备用。

2.1.2 定量用储备液的配制 精密称定黄芩苷、汉黄芩苷适量，加入甲醇溶解，配制成浓度为1 mg/mL的母液，于-20 ℃冰箱保存备用。

2.2 分析条件

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Thermo GOLD色谱柱(2.1 mm×100 mm, 3 μm)；柱温：30 ℃；流动相A：0.1%甲酸水溶液；流动相B：乙腈；进样量：2 μL；流速：0.2 mL/min。洗脱条件：0～4 min, 60%～30% A; 4～4.5 min, 30%～60% A; 4.5～5 min,60% A。

2.2.2 质谱条件 离子源：电喷雾电离源(electron spray ionization, ESI)；扫描方式：多反应离子检测(multiple reaction monitoring，MRM)模式，正离子模式下测定；离子化电压为5 500 V；离子源温度:400 ℃；去溶剂化温度：500 ℃；毛细管电压：3 600 V。内标物为利胆酚。各化合物离子对、去簇电压、碰撞电压参数见表1。

表1 黄芩苷、汉黄芩苷和利胆酚的质谱参数

2.3 细胞毒性 采用MTS法对不同浓度药物给药后的HEK293-OATP1B3细胞活性进行检测。取生长良好的HEK293-OATP1B3细胞，细胞浓度为每毫升 5×105个，接种于 96 孔板中，设置空白组、对照组、实验组(小檗碱、药根碱、盐酸巴马汀、黄连碱浓度梯度均为200、160、120、100、80、60、40、30、20、10、5 μmol/L)，每组6个复孔。于培养箱中静置培养 24 h后取出，每孔加入 20 μL 的 MTS 溶液，随后放回培养箱中温孵 1 h，最后用酶标仪(波长 490 nm)检测各孔的吸光度值(absorbance，A)，根据下列公式计算细胞存活率。

细胞存活率=(A实验组- A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%。

2.4 细胞摄取实验 将细胞分为阴性对照组(正常培养的目的细胞HEK-293加阴性对照病毒感染)，阳性转染组(正常培养的目的细胞HEK-293加目的基因过表达病毒感染)，抑制剂组(阳性转染组细胞分别给予不同浓度的小檗碱、黄连碱、药根碱、盐酸巴马汀)。抑制剂组细胞操作如下：取处于对数生长期的阳性转染组细胞，细胞密度为每毫升5×105个，每孔1 mL，接种于24孔板中，放入培养箱培养24 h。吸弃24孔板中旧培养基，加入37 ℃预热的HBSS缓冲液，反复清洗细胞2～3次，然后加入200 μL 37 ℃预热的HBSS缓冲液预孵育10 min。预孵育结束后，取出24孔板，每孔加入0.2 mL含药HBSS溶液(底物浓度：黄芩苷5 μmol/L、汉黄芩苷5 μmol/L；抑制剂浓度：小檗碱10、30、100 μmol)，药根碱10、30、100 μmol/L，盐酸巴马汀10、30、100 μmol/L，黄连碱10、30、100 μmol/L)进行摄取实验，孵育时间为15 min。待摄取结束后，吸弃孔中液体，加入预冷的HBSS缓冲液终止摄取，并清洗细胞2～3遍，最后吸尽孔中液体，每个孔中加入200 μL 无菌水，放置-80 ℃冰箱反复冻融3次。阴性对照组和阳性转染组细胞摄取实验操作同上(底物浓度：黄芩苷5 μmol/L、汉黄芩苷5 μmol/L，孵育时间为15 min)。

2.5 细胞样品处理 取细胞破碎液100 μL，加入100 μL含内标甲醇，涡旋震荡2 min，在4 ℃下15 000 r/min离心15 min，取上清液，于0.22 μm微孔滤膜过滤备用。取细胞破碎液适量用BCA试剂盒进行蛋白定量，测定蛋白含量。

2.6 样品含量测定 取“2.5”项下制备的细胞样品，按“2.2”项下分析条件进样,测定细胞破碎液中黄芩苷、汉黄芩苷的含量。

3 结果

3.1 方法学考察 在本实验分析条件下[8,13]，细胞样品中黄芩苷、汉黄芩苷、内标利胆酚色谱分离良好，通道中无杂质峰干扰，专属性良好。见图2。

精密吸取100 μL空白细胞破碎液，加入100 μL系列浓度甲醇混标溶液(含内标)，前处理后进样LC-MS/MS。纵坐标为黄芩苷、汉黄芩苷峰面积与内标物峰面积的比值，横坐标为浓度，采用1/(X2)加权方法，求得的直线回归方程见表2。

表2 细胞中黄芩苷、汉黄芩苷的线性方程

细胞样品低、中、高浓度的各质量控制样品精密度的RSD为1.37%～7.28%；准确度为-4.00% ～ 10.24%；提取回收率为93.37%～103.05%；24 h内稳定性的RSD为2.26%～4.68%。结果表明该方法对于细胞样品的精密度、准确度、提取回收率良好，并且样品24 h内稳定性良好，满足测定要求。

3.2 细胞毒性 小檗碱、药根碱、黄连碱、盐酸巴马汀对HEK293细胞的毒性结果见图2。当4种生物碱浓度在0～100 μmol/L时，细胞存活率均保持在90%以上，因此本实验选择0～100 μmol/L作为给药区间。

3.3 细胞摄取 阳性底物替米沙坦摄取结果显示，阳性转染组细胞摄取量为7.14 nmol/mg,阴性对照组细胞摄取量为0.42 nmol/mg，阳性转染组细胞摄取量约为阴性对照组细胞的16倍，表明阳性转染组细胞摄取功能良好，可以用于后续实验。

细胞摄取实验选取了黄连中4种主要生物碱成分作为抑制剂，每种生物碱设置了3个浓度梯度进行考察。阳性转染组对黄芩苷和汉黄芩苷的摄取量远高于阴性对照组，表明黄芩苷和汉黄芩苷均为OATP1B3的底物。抑制剂组的黄芩苷、汉黄芩苷摄取量远低于阳性转染组，表明4种生物碱均可显著抑制HEK293-OATP1B3细胞对黄芩苷和汉黄芩苷的摄取(P<0.05)。见图3。

注：1.利胆酚；2.黄芩苷；3.汉黄芩苷

注：A.小檗碱；B.药根碱；C.黄连碱；D.盐酸巴马汀

注：A.阴性对照组；B.阳性转染组；C. 10 μmol/L小檗碱组；D. 30 μmol/L小檗碱组；E. 100 μmol/L小檗碱组；F. 10 μmol/L黄连碱组；G. 30 μmol/L黄连碱组；H. 100 μmol/L黄连碱组；I. 10 μmol/L药根碱组；J. 30 μmol/L药根碱组；K. 100 μmol/L药根碱组；L. 10 μmol/L盐酸巴马汀组；M. 30 μmol/L盐酸巴马汀组；N. 100 μmol/L盐酸巴马汀组

4 讨论

黄芩主要活性成分是黄酮类化合物，如黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素[14-15]，黄芩中黄酮类化合物具有多种药理活性，可用于治疗糖尿病、抗炎、抗肿瘤、抗氧化等。小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、黄连碱、表小檗碱等生物碱是黄连主要活性成分[16]，常用于治疗腹泻，并被证实具有显著的广谱抗菌和抗炎活性。黄芩-黄连作为药对配伍使用，是泻心汤等众多复方重要组方成分，常用于治疗阳明热病[6]；在现代药理学研究中，常用于治疗2型糖尿病[7]。目前，对于黄芩黄酮的肠道吸收机制已有研究[11,17]，但是并不足以说明黄芩、黄连合用后药理学和治疗效果发生改变的潜在机制，因此黄芩、黄连的配伍机制仍具有较高的研究价值。

动物体内实验虽然能准确地反映黄芩-黄连联合给药后的药物动力学和药效学变化,但很难从细胞或分子水平上阐明二者之间相互作用的影响机制。HEK293细胞是一种细胞转染的常用工具细胞，具有转染效率高、易于培养等优点。稳定转染OATP1B3的HEK293细胞常用于药物转运功能的考察[8,18]。因此，本实验选择HEK293-OATP1B3细胞用于药物转运功能的考察，选择OATP1B3的特异性阳性底物替米沙坦[4]进行细胞转运功能的验证，结果表明该细胞的转运功能良好，适合用于药物转运实验。

课题组的前期研究已经证实，黄芩黄酮的体内转运过程受OATP1B3转运体调控，并且黄芩苷和汉黄芩苷为OATP1B3转运体的底物[8,11]，同时已有报道[10]证明，黄连主要成分小檗碱也为该转运体的底物。但是在常用药对黄芩-黄连配伍中，黄连对OATP1B3转运黄芩苷和汉黄芩苷功能的影响尚不明确。因此，本实验对黄连生物碱影响OATP1B3转运黄芩苷和汉黄芩苷的功能进行验证。在药物转运实验中，黄芩苷、汉黄芩苷的摄取条件参考课题组前期的细胞摄取动力学研究结果[8]，然后选用黄连中含量较多的生物碱成分作为抑制剂，发现黄连主要生物碱成分均具有抑制OATP1B3转运黄芩苷和汉黄芩苷的功能。

综上所述，黄连生物碱可抑制OATP1B3对黄芩苷和汉黄芩苷的转运。因此，推测黄连改变黄芩黄酮体内药物动力学特征的机制与黄连抑制OATP1B3对黄芩苷和汉黄芩苷的转运有关，但其体内变化的具体机制仍待进一步研究。