美洲大蠊和德国小蠊肠道内生真菌的分离鉴定及拮抗昆虫病原真菌的初步研究

乐倩倩，钮徐融，谢永辉，刘全俊，詹莜国，柯昌磊，李微杰，张 倩，张心雨，张瑞玲，张 忠，王志江*

（1.云南省烟草公司 昆明市公司，云南 昆明 650051；2.山东第一医科大学(山东省医学科学院) 基础医学院，山东 泰安 271016；3.云南农业大学 植物保护学院，云南 昆明 650201）

美洲大蠊（Periplaneta american）和德国小蠊（Blattella germanica）属于节肢动物门昆虫纲蜚蠊目，长期滋生在下水道、化粪池以及居民生活区的排污管等处，拥有超强的繁殖能力和抗病性，甚至会对常用杀虫剂产生耐药［1］。昆虫病原真菌生物制剂，作为一种安全、高效、持效期长且不易产生抗药性的生物防治手段，逐渐引起了人们的高度重视。但有研究表明蟑螂体内的某些共生菌能帮助其抵抗虫生真菌的感染。德国小蠊体内，尤其是肠道内有多种内共生菌［2］，这些内共生微生物是昆虫正常生长发育所必需的，不仅参与昆虫维生素合成吸收、脂肪和糖类利用以及氮循环，而且在抵抗外来病原微生物的入侵、定殖以及免疫系统的加强中起着至关重要的作用［3-4］。如从德国小蠊肠道中分离的细菌菌株Bacillus subtilis［5］和Pseudomonas reactans［6］不仅能够抑制白僵菌分生孢子的萌发，而且能够抑制菌丝的生长，具有抗白僵菌感染活性。目前，针对蟑螂肠道真菌抗常见昆虫病原真菌感染的反应研究未见报道。本研究从美洲大蠊和德国小蠊体内分离获得了16种真菌菌株，通过平板对峙法从中筛选出对常见昆虫病原真菌——球孢白僵菌（Beauveria bassiana）和莱氏野村菌（Nomuraea rileyi）具有拮抗作用的菌株，为探讨2种蜚蠊对常见昆虫病原真菌的抗病机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试虫来源

美洲大蠊和德国小蠊种群均来自济南市疾病预防控制中心引种，于2005年在山东第一医科大学病媒生物与虫媒病实验室饲养至今，饲养条件为：温度（26±1） ℃，相对湿度（60±10）%，光照12∶12 （L∶D），提供兔饲料作为食料。

1.2 供试昆虫病原真菌

选择2种常见昆虫病原真菌作为对峙试验的供试病原菌，即球孢白僵菌（Beauveria bassiana）和莱氏野村菌（Nomuraea rileyi），这2种真菌均为本实验室自主分离的菌种。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备 取德国小蠊若虫5个阶段，成虫1个阶段，其中成虫阶段分雌虫和雄虫，共7种虫态，每个阶段各设置3组重复，取样前，德国小蠊需要饥饿24 h。取样时，第1和第2阶段的若虫置于无菌离心管内，用75%酒精浸泡10 min后，用无菌水漂洗3次，去除表面细菌，然后再进行研磨取样；其余各阶段的取样，同上进行体表消毒后，在无菌的环境下，解剖取其肠道，置于无菌离心管内，再进行研磨取样。美洲大蠊取样相同。

1.3.2 可培养真菌的培养 参照黄振东等［7］传统分离培养法分离纯化德国小蠊肠道可培养真菌，取1.3.1中充分研磨的样品加入200 μL的无菌水混匀，取50 μL混合液稀释成3个不同浓度（10-4、10-6、10-8），各取50 μL均匀涂布在真菌培养基上，放入培养箱28 ℃下培养72 h。待真菌生长后，分离纯化得到单个菌株，去除重复菌种。美洲大蠊操作相同。

1.3.3 可培养真菌的鉴定 参照唐万达等［8］分子鉴定方法提取及鉴定真菌DNA，氯仿法提取DNA，真菌的ITS序列的PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，送至青岛睿博基因公司测序，最后将得到的测序序列在NCBI网站的GenBank上进行BLAST同源性比对。

1.3.4 拮抗菌种筛选 内生真菌对病原真菌的拮抗作用采用五点对峙培养法［9］进行测定。在直径为9 cm的PDA平板正中央接入直径为5 mm的昆虫病原菌菌饼，同时在平板4个距供试菌菌饼2.5 cm处接入相同大小的内生真菌菌饼，以只接病原真菌、不接肠道真菌的平板作为对照，每个处理重复3次，25 ℃条件下培养。每24 h观察1次，从对峙培养第3天起测量病原真菌菌落直径和抑菌带距离。抑菌带距离（D）为内生真菌菌落与供试菌菌落之间的无菌区域宽度。抑制率（inhibitory rate，IR）公式为：

2 结果与分析

2.1 蜚蠊肠道可培养真菌分子鉴定结果

在美洲大蠊肠道中分离得到8属12株内生真菌，德国小蠊肠道中分离得到3属4株内生真菌（表1）。

表1 美洲大蠊和德国小蠊肠道内生真菌Blast对比结果

2.2 蜚蠊肠道内生真菌对昆虫病原真菌的抑菌效果

2种蜚蠊肠道内生真菌对2种昆虫病原真菌的拮抗作用分为强（抑制率≥75%）、较强（50%≤抑制率＜75%）和弱（抑制率＜50%）3个等级［10］，抑制率在75%以上视为拮抗活性显著。本研究结果表明，2种蜚蠊肠道内存在具有较强的昆虫病原真菌拮抗活性的真菌，有5株肠道内生真菌对球孢白僵菌具有拮抗作用，占可培养肠道内生真菌菌株总数的31.25%，且这5株肠道内生真菌对球孢白僵菌的抑制率都达到50%以上，拮抗活性较强。有9株肠道内生真菌对莱氏野村菌具有拮抗作用，占可培养肠道内生真菌菌株总数的56.25%。此外，16株内生真菌中对2种病原真菌的抑制率均达50%以上的有1株，占6.25%；只对1种病原真菌的抑制率达到50%以上的有6株，占37.50%；而对2种供试菌的抑制率皆低于10%的有6株，占37.50%，这6种真菌的拮抗活性最弱或没有活性。由此可知，美洲大蠊和德国小蠊肠道内生真菌中广泛存在着抑菌活性真菌，并呈现出对2种昆虫病原真菌有不同程度的抑制作用，拮抗作用和强度存在差异（表2）。

表2 肠道内生真菌拮抗病原真菌的抑制率及抑菌带距离

从抑菌带宽度来看（表2），菌株D4在拮抗莱氏野村菌的平板中抑菌带宽度为0 mm，并不完全代表病原真菌生长受到很强的抑制，与真菌本身生长速度也有关。本试验发现，菌株D4生长速度较快，在对峙培养的第4天后，其菌落呈覆盖式生长，具有较强的营养竞争能力，生长竞争强，能迅速占领生长空间（图1f），与之对峙培养的莱氏野村菌生长较慢，导致其无法扩增其菌落，直接被D4真菌菌丝全部覆盖。

在菌株M7与球孢白僵菌的对峙培养中（图1b），两者菌落之间不仅出现抑菌带，而且菌株M7菌落随着生长时间的延长，在接触抑制处时分泌出黑紫色物质，随着时间的增长颜色逐渐加深，并且在M7菌落靠近拮抗处有黄色渗出液渗出，且慢慢转变为黑色颗粒。在菌株D4与球孢白僵菌的对峙培养中（图1c），随着菌株D4的生长，球孢白僵菌的生长受到抑制，与对照组（图1a）相比，菌落边缘菌丝淡化，贴近培养基且变色几乎没有气生菌丝。

同样，有些菌株的菌落虽然自身生长速度缓慢，如图1d和图1g中的肠道内生真菌，但抑菌能力强（抑制率=100%）。图1d为菌株M8，使球孢白僵菌生长受抑制，并形成较宽的抑菌带。同样从表2可知：菌株M8对球孢白僵菌和莱氏野村菌均表现出较强的拮抗活性，抑制率分别达54.28%和100.00%。

图1 肠道内生真菌对2种病原真菌的拮抗作用

3 讨论与结论

本研究利用传统分离培养法，从2种蜚蠊肠道内分离得到16株可培养真菌。美洲大蠊肠道内分离得到的内生真菌以假丝酵母属为主，占美洲大蠊肠道内分离得到的可培养真菌总株数的25%，共3株，分别 为C. palmioleophila、C. viswanathii和C. duobushaemulonii；德国小蠊肠道内分离得到的内生真菌以曲霉属为主，占德国小蠊肠道内分离得到的可培养真菌总株数的50%，共2株，分别为A. candidus和A. flavus，这与马涛等［11-12］在野外不同生境采集到的2种蜚蠊样本肠道内生菌的研究结果基本一致。本研究分离得到的蜚蠊肠道内生真菌的种属和抗菌活性分布具有多样性，但菌株数量较其他研究有所减少，可能与本研究所用的德国小蠊由于在实验室内长期饲养致其肠道菌群因食物单一而变得更为单一有关。上述研究结果表明，蜚蠊肠道内生真菌组成与其生长环境具有相关性，野外或其他生境下取样的美洲大蠊和德国小蠊肠道内生真菌组成较实验室内长期饲养的蜚蠊肠道内生真菌组成更为复杂。

在2种蜚蠊肠道内分离得到的可培养真菌中，对球孢白僵菌和莱氏野村菌均有拮抗作用的有10种，占2种蜚蠊肠道内分离可培养真菌总株数的62.50%。且不同属的肠道内生真菌对同一病原真菌表现出不同程度的拮抗性，同种属的菌种其抑菌活性亦存在相似性或差异性。从抑菌带宽度来看，多数对峙结果中的抑菌带宽度为3 mm左右。真菌拮抗机制通常包括多重作用，如重寄生、竞争、分泌抑菌物质和产生抑菌挥发性气体等［13-14］。例如菌株M7在与球孢白僵菌的对峙培养中，两者菌落之间不仅出现抑菌带，且在接触抑制处时分泌出黑紫色物质。正如其他同属菌株产生的醛类、烯类及醇类物质会抑制病原真菌生长［15］，结合试验结果推测A. candidus随着对峙培养时间的增长，拮抗作用随之增强，且会在拮抗处分泌某种拮抗物质。

同样，有些菌株的菌落虽然生长速度慢，但这类肠道内生真菌可能会释放一些代谢产物到培养基中，或产生一些挥发性抑菌气体，使病原真菌生长受抑制［14］。在通常情况下，真菌的分生孢子生长越多，成功萌发后才会穿透昆虫体壁并侵入体腔内，其作为微生物杀虫剂的致病能力就越高。在平板对峙中，受拮抗的莱氏野村菌白色菌丝少见，不利于绿色分生孢子的产生，与致病毒力相关的菌体生理代谢产物草酸钙结晶相应地减少。说明某些肠道内生真菌的相关活性物质抑制了莱氏野村菌分生孢子的产生，降低了草酸产生的能力，从而降低了该真菌的侵袭力。草酸钙结晶是病原真菌的生理代谢产物，且与其对寄主的侵染力有直接关系，能使寄主昆虫血液变性，从而破坏血细胞［16］。

本研究从美洲大蠊和德国小蠊肠道内分离筛选到对病原真菌具有拮抗作用的真菌，不仅从肠道共生体真菌的角度解释了蜚蠊不易受昆虫病原真菌感染、免疫力增强的原因，而且为开发新型生物蜚蠊防治剂提供了借鉴。在美洲大蠊肠道内筛选出可同时抑制球孢白僵菌和莱氏野村菌生长的A. candidus和K. blattae，这2种真菌显示出较强的拮抗活性。A. candidus和K. blattae这2种真菌拮抗球孢白僵菌和莱氏野村菌感染的机制有待进一步研究，以期为从其他方面提高球孢白僵菌和莱氏野村菌粉毒力、增强防治效果提供一定的参考意义。