宏基因组二代测序技术在重症肺炎病原学诊断中的应用价值

吴 昊，程海林，方玉林，王溪清，谢文剑

(海军安庆医院呼吸与危重症医学科，安徽 安庆 246001)

肺炎是常见的呼吸系统疾病，重症肺炎病情进展迅速，且可伴有血流感染、多器官功能衰竭和休克等多种并发症[1]，是全球感染性疾病患者死亡的重要原因[2]。快速准确地识别病原微生物是重症肺炎精准治疗的最大挑战之一[3]。血流感染作为重症肺炎患者最常见的一种并发症，被广泛认为是预后恶化的独立预测因素[4]。因此，早期快速确定病原微生物及识别重症肺炎患者是否发生血流感染对准确选择抗菌药物及改善患者预后具有重要意义[5]。目前，微生物的鉴别仍然是以传统培养病原体方法为主，但该方法检测阳性率低、培养时间较长。重症肺炎患者病情变化迅速，传统检测方式对抗感染方案的指导存在诸多局限[6]。宏基因组二代测序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)是一种新的病原微生物检测方法，它不依赖传统的微生物分离培养，也不需要提前预测疑似病原体，而是对样本中的核酸进行高通量测序，将核酸序列信息与数据库进行比对，从而确定样本中含有的所有潜在致病微生物[7]。mNGS弥补了传统检测方法的不足，具有准确、高效、覆盖范围广的特点[8]。多项研究表明mNGS在重症肺炎患者支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)或血液样本病原体精确检测中具有较高应用价值[9-10]。本研究旨在探讨应用mNGS同时检测BALF和血液样本在重症肺炎病原学诊断中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料选择2020年1月至2021年12月于海军安庆医院就诊并确诊为重症肺炎的65例患者作为研究对象。纳入标准：(1)年龄18～70周岁；(2)符合2007年美国胸科学会/美国传染病学会制定的成人重症肺炎的诊断标准；(3)患者或其家属同意对BALF和血液标本进行mNGS及常规实验室微生物检测。排除标准：(1)拒绝进行支气管镜检查或者有支气管镜检查禁忌证者；(2)临床或实验室资料不完整者；(3)非感染性疾病患者；(4)妊娠期或哺乳期患者。本研究获得了医院伦理委员会批准，所有患者均自愿参与研究，并签署了知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 一般资料、BALF和血液标本的收集 查阅患者病历，记录患者的性别、年龄、基础疾病及是否行机械通气等资料。根据患者入ICU 24 h内的各项生理学参数和实验室检查结果的最差值，计算出急性生理与慢性健康评分(Acute physiology and chronic health evaluation，APACHE II)和肺炎严重指数(Pneumonia severity index，PSI)。入院后留取患者外周静脉血2 mL，并行纤维支气管镜检查，留取BALF。对影像学表现最明显的肺炎段行肺泡灌洗，方法为：一次性快速注射生理盐水10 mL，15 s后，在200 mmHg负压下，将3 mL以上的BALF回收到标本管中。

1.2.2 常规实验室微生物检测及结果判读 常规实验室微生物检测包括微生物分离培养和涂片镜检、聚合酶链反应检测、抗体和抗原检测、利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测、半乳甘露聚糖试验。结果判读：在排除背景病原体后，如果常规病原学检测中的任意一项呈阳性，且与临床特征符合，则判为阳性结果。

1.2.3 mNGS检测及结果判读 患者BALF和血标本由华大基因公司进行mNGS检测，采用mNGS技术分析样本中微生物的核酸序列，通过与数据库中现有微生物的核酸序列比较，鉴定标本中的微生物。结果判读：(1)对于细菌(不包括分枝杆菌)、病毒和寄生虫，mNGS鉴定出物种水平的覆盖率比其他任何微生物高出10倍时判定为阳性；(2)真菌：mNGS鉴定出的微生物的覆盖率是其他真菌的5倍，曲霉菌以属严格序列数(SMRNG)或种严格序列数(SMRN)≥2时则判定为阳性；(3)结核分枝杆菌至少有一个序列映射到种或属水平时可认为阳性。

2 结果

2.1 基本资料65例重症肺炎患者中，男性41例，女性24例，平均年龄(58.65±11.27)岁；有54例存在基础疾病，包括糖尿病14例(21.54%)，高血压22例(33.85%)，心血管疾病7例(10.77%)，脑血管疾病5例(7.69%)，慢性呼吸道疾病4例(6.15%)，慢性肝脏疾病4例(6.15%)，肾功能不全3例(4.62%)，恶性肿瘤放化疗5例(7.69%)，自身免疫性疾病6例(9.23%)；APACHE II和PSI得分的M(Q1，Q3)分别为16(12，22)分和112(90，135.0)分。48例(73.85%)患者行机械通气，17例(26.15%)患者未行机械通气。

2.2 mNGS与常规检测方法结果的比较及一致性检验在65例重症肺炎患者中，56例(86.15%)患者BALF的mNGS检测结果呈阳性，32例(49.23%)患者BALF常规检测方法结果呈阳性，两者检测阳性率差异有统计学意义(χ2=20.260，P<0.001)。其中31例mNGS和常规检测结果均为阳性，8例mNGS和常规检测结果均为阴性，25例仅mNGS检测阳性，1例仅常规检测阳性，一致性结果显示Kappa值为0.208<0.4，说明两种检测方法的一致性较差，见表1。

表1 BALF mNGS与常规检测方法结果比较/例

25例(38.46%)患者的血标本mNGS检测结果呈阳性，14例(21.54%)患者血标本常规检测结果呈阳性，两组检测阳性率差异有统计学意义(χ2=4.432，P=0.035)。其中12例mNGS和常规检测结果均为阳性，38例mNGS和常规检测结果均为阴性，13例仅mNGS检测阳性，2例仅常规检测阳性，一致性结果显示Kappa值为0.469<0.75，说明两种检测方法的一致性较为一般，见表2。

表2 血标本mNGS与常规检测方法结果比较/例

2.3 BALF中mNGS与常规检测方法检测的病原体分布比较mNGS检测结果显示29例(44.62%)患者BALF中检出细菌，其中11例检出革兰氏阳性菌(G+菌)，24例检出革兰氏阴性菌(G-菌)，2例检出结核分枝杆菌；25例(38.46%)患者BALF中检出真菌，其中14例检出耶氏肺孢子菌，9例检出曲霉菌，5例检出念珠菌；16例(24.62%)患者BALF中检出病毒，1例患者BALF中检出支原体。常规检测方法结果显示18例(27.69%)患者BALF中检出细菌，其中7例检出G+菌，15例检出G-菌；12例(18.46%)BALF中检出真菌，其中2例检出耶氏肺孢子菌，7例检出曲霉菌，6例检出念珠菌；6例(9.23%)BALF中检出病毒。BALF中mNGS检出细菌、真菌和病毒的阳性率均显著高于常规检测方法，差异有统计学意义(P均<0.05)，见表3。

表3 BALF中mNGS与常规检测方法病原体检出情况比较/例

2.4 血标本中mNGS与常规检测方法检测的病原体分布比较mNGS检测结果显示，17例(26.15%)患者血标本中检出细菌，其中5例检出G+菌，13例检出G-菌；10例(15.38%)患者血标本中检出真菌，其中6例检出曲霉菌，5例检出念珠菌。常规检测方法结果显示，8例(12.31%)患者血标本中检出细菌，其中3例检出G+菌，6例检出G-菌；6例(9.23%)血标本中检出真菌，其中4例检出曲霉菌，4例检出念珠菌。血标本中mNGS检出细菌的阳性率显著高于常规检测方法(P<0.05)，而mNGS检出真菌的阳性率与常规检测方法比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4 血标本中mNGS与常规检测方法病原体检出情况比较/例

2.5 不同样本mNGS检测阳性率的比较采用mNGS检测BALF的阳性率(56例，86.15%)显著高于血样本的阳性率(25例，38.46%)，差异有统计学意义(χ2=31.476，P<0.001)。血样本mNGS检测阳性的25例患者，BALF的mNGS检测也均为阳性，并且mNGS检测到的BALF与血样中的病原体高度一致。

2.6 治疗方案调整情况及结局患者入院时依据其病史、临床症状及常规检查结果，予以经验性抗感染及对症治疗。根据mNGS检测结果，共对27例患者调整了抗感染治疗方案，最终18例患者好转后出院，9例患者死亡。

3 讨论

重症肺炎是一种进展迅速、死亡率高的疾病。患者病情复杂，除了会出现发热、咳嗽、咳痰等一般临床症状，还可能短时间内出现呼吸衰竭的症状，严重者可出现昏迷和意识障碍，导致脑疝和中枢性呼吸衰竭死亡[11]。研究显示，该疾病还可出现血流感染、多器官功能衰竭和休克等多种并发症[12]。对重症肺炎患者早期实施精准抗感染干预及早期发现重症肺炎患者的败血症或血流感染是缩短住院时间、改善预后的关键。在临床上，常给予经验性抗感染治疗，通常使用一些广谱抗生素，甚至多种抗生素联合使用。由于缺乏准确的病原学证据，常导致广谱抗生素的过度使用，致使微生物耐药性增加，影响治疗效果。目前，临床上应用的培养、涂片、抗原抗体检测、分子诊断等常规微生物检测方法具有较多局限性，培养所需时间长，且阳性检出率不高；抗原抗体检测容易受到患者自身状态等因素的影响，如机体免疫状态、年龄，结果准确性不高；分子诊断虽然灵敏度较高、检测速度较快，但是以预先假设的特异性病原体为前提进行核酸扩增，病原微生物的漏检率较高[9，13-14]。崔凤婷等[9]的研究表明，应用mNGS检测重症肺炎儿童患者BALF中的病原微生物，可提高阳性检出率。徐玉惠[10]分别对35、37、38例不同患者中应用mNGS和常规方法检测血、痰、BALF样本中的病原体，结果发现3种样本mNGS检测的阳性率均显著高于同组常规检测方法的阳性率。

本研究应用mNGS同时检测65例重症肺炎患者BALF和血液样本，并与常规检测方法进行了对比。结果显示，无论是在BALF还是在血标本中，mNGS检测的阳性率均显著高于常规检测方法。BALF中mNGS检出细菌、真菌和病毒的阳性率均显著高于常规检测方法；血标本中mNGS检出细菌的阳性率显著高于常规检测方法，而mNGS检出真菌的阳性率与常规检测差异无统计学意义。这一结果出现的可能原因是：(1)在重症肺炎患者中，应用mNGS检测BALF中病原微生物种类效果优于血样本；(2)血液样本中真菌感染的例数较少，因此不能全面地反映mNGS的检测效能。

此外，对于血样本mNGS检测阳性的25例患者，BALF的mNGS检测也均为阳性，并且mNGS检测到的BALF与血样中的病原体高度一致。这一结果提示，病原体可能在很大程度上从重症肺炎患者的肺部传播到血液中。本研究根据mNGS检测结果，共对27例患者调整了抗感染治疗方案，最终18例患者好转后出院，9例患者死亡。

本研究存在一定局限性。首先，研究对象和样本均来自同一家医院，因此选择偏倚不可避免；其次，本研究的样本量较小，这可能也会对结果的准确性产生影响。今后将考虑扩大样本量，进行多中心研究，以获得更为准确的结果。

综上所述，对重症肺炎患者应用mNGS方法检测，可提高病原微生物的检出阳性率，从而指导临床医生调整抗感染治疗方案。