肝细胞癌中IL-33/ST2的表达与巨噬细胞浸润的相关性研究

依力哈木·买买提，钟 锴，郭 强，肖开提·阿不都哈德尔

(新疆医科大学第一附属医院医务部门诊部日间病房，乌鲁木齐 830054)

肝细胞癌是一种最常见的原发性肝癌，具有高度侵袭性、复发率和病死率高、预后差等特性，促进其发展的主要因素包括乙型和丙型肝炎病毒感染、酒精性脂肪肝炎等[1-3]。肿瘤细胞所处的微环境，包括成纤维细胞、内皮细胞、炎症细胞、细胞因子及细胞外基质在调节肿瘤细胞活动、促进肿瘤恶性进展和对治疗产生应答过程中起着重要的作用[4-5]。巨噬细胞是一种具有异质性的免疫细胞，在慢性损伤和相关趋化因子的作用下聚集到肿瘤组织周围并可转化为M1型或M2型巨噬细胞。恶性肿瘤微环境中的巨噬细胞主要以M2型为主，通过免疫抑制、促进血管形成、分泌一系列细胞因子和生长因子等促进肿瘤的进展[6-7]。研究表明，IL-33/ST2信号通路参与肝脂肪变性、肝炎、纤维化、肝硬化、肝癌等发生和转归[8]。此外，在呼吸系统恶性肿瘤中，IL-33/ST2通过调控巨噬细胞向M2型极化、增加免疫抑制性分子的分泌，促进肿瘤细胞的快速生长和转移[9]。目前，在肝细胞癌肿瘤微环境中关于IL-33/ST2信号通路与巨噬细胞极化之间相关性的研究甚少。因此，本研究通过检测肝细胞癌组织中巨噬细胞标志物CD68、M1型巨噬细胞标志物S100A9、M2型巨噬细胞标志物CD163、IL-33、ST2的表达水平，初步探讨IL-33/ST2信号通路在肝细胞癌肿瘤微环境巨噬细胞极化种的作用，为肝细胞癌的作用机制和治疗靶点研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 组织标本收集2020年5月至2021年5月新疆医科大学第一附属医院经手术切除的30例肝细胞癌患者的组织标本，包括癌组织标本和远端肝组织标本。本研究获得了新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准，并组织标本获取均有知情同意书。所有患者术前均未接受其他治疗且临床资料完整。按照国际抗癌协会(UICC)提出TNM分期标准，Ⅰ期17例(56.67%)，Ⅱ期7例(23.33%)，Ⅲ期6例(20.00%)。其中，男性患者20例(66.67%)，女性患者10例(33.33%)，年龄40～75岁，中位年龄为50.5岁。收集的组织标本一半置于4%多聚甲醛溶液固定、经常规脱水、石蜡包埋，切厚为4 μm薄片用于病理染色；而另一半直接置于-80 ℃保存用于实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测。

1.2 试剂兔多克隆抗体CD68，兔单克隆抗体CD163、S100A9、IL-33、ST2，辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗、二氨基联苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)显色试剂盒购自英国Abcam公司。4%多聚甲醛溶液、PBS缓冲液、山羊血清封闭液购自北京中杉金桥生物技术有限公司。柠檬酸钠抗原修复液、3% H2O2溶液及中性树胶购自北京傲锐东源生物技术有限公司。Trizole、RNA逆转录试剂盒、SYBR购自大连TaKaRa公司。

1.3 方法

1.3.1 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色 石蜡包埋的肝细胞癌组织标本经常规脱蜡后，苏木素溶液染色1.5～2 min，盐酸乙醇溶液分化2～5 s，伊红溶液染色1～1.5 min。经脱水、透明、中性树胶封片后，显微镜下观察肝细胞癌组织的基本病理变化并采集图像。

1.3.2 免疫组织化学染色 石蜡包埋的肝细胞癌组织标本常规脱蜡，PBS溶液冲洗3次×5 min，枸橼酸抗原修复液进行高温抗原修复15 min，PBS缓冲液冲洗3次×5 min，3%过氧化氢溶液中孵育10 min，PBS缓冲液冲洗3次×5 min。滴加5%山羊血清进行封闭1 h，随后加入足量一抗(CD68 ab213363,1∶100；CD163 ab182422,1∶200；S100A9 ab63818,1∶200；IL-33 ab207737,1∶1 000；ST2 ab194113,1∶1 000)4 ℃孵育过夜。第二天，复温1 h，PBS缓冲液洗3次×5 min，滴加足量HRP标记的二抗(ab205718,1∶1 000)孵育90 min；PBS缓冲溶液冲洗3次×5 min，用DAB显色液(ab64238)显色。经苏木精复染、盐酸乙醇分化、脱水、透明、中性树胶封片后，显微镜下观察阳性染色并采集图片。使用ImageJ软件对肝细胞癌组织和远端肝组织中的阳性区域面积进行统计分析。

1.3.3 qRT-PCR检测 称取100±10 mg组织标本置于菌研钵中，倒入少量液氮研磨组织至粉末状，加入1 mL TRIzole试剂，继续研磨成粉末状；室温静置10 min后加入0.2 mL氯仿剧烈震荡混匀，室温静置10 min，4 ℃，12 000 g离心15 min；吸取上清液加入等量异丙醇混匀后静置10 min，4 ℃，12 000 g离心10 min；弃去上清液加入75%乙醇后，4 ℃，7 500 g离心5 min；弃去上清液室温干燥后加入50～100 μLDEPC溶解RNA沉淀。按照逆转录试剂盒说明书操作逆转录为cDNA，其条件为：37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃ 5 min。参照PCR扩增试剂盒说明书扩增DNA，其条件为：94 ℃进行预变性4 min；94 ℃进行变性30 s；60 ℃进行退火30 s；72 ℃进行延伸30 s；总共40个循环；以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为管家基因，2-△△Ct方法计算目的基因mRNA相对表水平，ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt癌组织-ΔCt远端肝组织，2-△△Ct表示癌组织目的基因mRNA的相对含量较远端肝组织所改变的倍数。引物由生工生物(上海)股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 统计学处理采用SPSS22.0软件进行数据处理和分析。计量资料中的数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验，以Pearson相关系数分析变量之间的相关性。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝细胞癌组织的病理变化HE染色结果显示，在癌组织中可见核大而不规则的癌细胞，呈多角形排列成巢状，索间有丰富的血窦，核仁明显；而远端肝组织形态基本正常(图1)。在30例肝细胞癌患者中高、中分化22例(73.33%)，低分化8例(26.67%)，伴有淋巴结转移4例(13.33%)。

图1 HE染色观察基本病理变化

2.2 巨噬细胞标志物CD68的表达巨噬细胞标志物CD68定位于癌组织的间质中，呈淡黄色或棕黄色，而远端肝组织中仅有少量表达；定量结果显示，肝细胞癌组织中巨噬细胞标志物CD68的百分比为(12.81±2.95)%，而远端肝组织中的百分比为(1.01±0.23)%，差异有统计学意义(t=11.98，P<0.01)，见图2。qRT-PCR结果显示，癌组织中CD68 mRNA表达量(4.71±0.27)明显高于远端肝组织(1.07±0.02)，差异有统计学意义(t=99.72，P<0.01)，见图3。

注：与远端肝组织比较，**P<0.01。

2.3 M1、M2型巨噬细胞标志物的表达M2型巨噬细胞标志物CD163定位于肝细胞癌组织的间质中，呈淡黄色或棕黄色，而远端肝组织中仅有少量表达；定量结果显示，肝细胞癌组织中M2型巨噬细胞标志物CD163的百分比为(9.43±1.83)%，而远端肝组织中的百分比为(1.93±0.49)%，差异有统计学意义(t=10.66，P<0.01)，见图2。qRT-PCR结果显示，癌组织中CD163 mRNA表达量(3.73±0.11)明显高于远端肝组织(1.08±0.02)，差异有统计学意义(t=57.90，P<0.01)，见图3。

注：与远端肝组织比较，**P<0.01。

M1型巨噬细胞标志物S100A9主要定位于肝细胞癌组织的间质中，呈分散分布，远端肝组织中仅有少量表达；定量结果显示，肝细胞癌组织中M1型巨噬细胞标志物S100A9为(4.36±0.96)%，而远端肝组织为(0.70±0.20)%，差异有统计学意义(t=10.60，P<0.01)，见图2。qRT-PCR结果显示，肝细胞癌组织中S100A9 mRNA表达量(2.13±0.13)明显高于远端肝组织(1.08±0.01)，差异有统计学意义(t=34.29，P<0.01)，见图3。肝细胞癌组织中的M2型巨噬细胞标志物CD163的密度显著高于远端肝组织(图4)。

图4 M1、M2型巨细胞在肝细胞癌组织的比例

2.4 IL-33、ST2的表达IL-33阳性细胞定位于癌组织的间质中，在血管周围高表达，而远端肝组织中仅有少量表达；定量结果显示，肝细胞癌组织中IL-33阳性细胞为(6.94±0.96)%，而远端肝组织中为(1.54±0.41)%，差异有统计学意义(t=11.98，P<0.01),图5。qRT-PCR结果显示，癌组织中IL-33 mRNA表达量(3.44±0.31)明显高于远端肝组织(1.05±0.03)，差异有统计学意义(t=32.53，P<0.01)，见图6。

注：与远端肝组织比较，**P<0.01。

进一步分析ST2表达情况，结果显示，ST2阳性细胞定位于癌组织的间质中，呈淡黄色或棕黄色，而远端肝组织中仅有少量表达；定量结果显示，肝细胞癌组织中ST2阳性细胞的百分比为(13.42±1.85)%，而远端肝组织中的百分比为(3.25±0.54)%，差异有统计学意义(t=14.91，P<0.01),图5。qRT-PCR结果显示，癌组织中ST2 mRNA表达量(3.64±0.65)高于远端肝组织(1.01±0.02)，差异有统计学意义(t=17.02，P<0.01)，见图6。

注：与远端肝组织比较，**P<0.01。

2.5 IL-33、ST2在肝细胞癌组织的表达与M1、M2型巨噬细胞标志物表达之间的相关性分析相关性系数分析结果显示，IL-33、ST2的表达水平与M2型巨噬细胞标志物CD163在肝细胞癌组织中的表达呈明显正相关(均R2=0.97，P<0.01)，见图7。IL-33、ST2的表达水平与M1型巨噬细胞标志物S100A9在肝细胞癌组织中的表达无相关性(P>0.05)，见图8。

图7 IL-33、ST2在肝细胞癌组织中的表达与CD163表达之间的相关性

图8 IL-33、ST2在肝细胞癌组织中的表达与S100A9表达之间的相关性

2.6 CD68、CD163、S100A9、IL-33及ST2在肝细胞癌组织的表达与临床指标之间的相关性相关性系数分析结果显示，CD68、S100A9、IL-33及ST2等指标在肝细胞癌组织的表达与性别、年龄、TNM分期、分化程度、淋巴结转移等临床指标之间无相关性(P>0.05)，见表2。M2型巨噬细胞标志物CD163在肝细胞癌组织中的表达与肝细胞癌的分化程度之间呈正相关(P<0.05)，而与与性别、年龄、TNM分期、淋巴结转移等临床指标之间无相关性(P>0.05)。

表2 CD68、CD163、S100A9、IL-33及ST2在肝细胞癌组织的表达与临床指标的相关性

3 讨论

肝细胞癌作为消化系统最常见恶性肿瘤之一，起病隐匿，大多数患者未被及时发现、病情进展迅速，就诊时已处于中晚期，无法接受根治性手术治疗。肝细胞癌的发生发展涉及到多步骤、多阶段和多因素，其中肿瘤微环境在肝细胞癌的侵袭、转移及复发过程中起到至关重要的作用[10-11]。因此，研究肿瘤微环境中浸润的免疫细胞类型、动态相互作用，有助于探索肝细胞癌免疫治疗的有效靶点。

巨噬细胞是一类肿瘤微环境中浸润的免疫细细胞，具有极强的可塑性和异质性，通过产生大量细胞因子、生长因子、趋化因子等途径促进肿瘤细胞的生长和存活，加速新生血管形成，多种途径影响机体抗肿瘤免疫反应[12-13]。聚集到肿瘤组织周围的巨噬细胞在长期慢性肝损伤的刺激下可被转化为M1型或M2型巨噬细胞，这两种表型的巨噬细胞对肿瘤的进展具有相反的作用，即M1型巨噬细胞高表达主要组织相容性复合物I类和II类分子，具有促炎、抗原提呈、吞噬、激活免疫应答等特性，发挥抑瘤活性；而M2型巨噬细胞激活IL-10、IL-13等抗炎介质、抑制炎症反应，促进组织重塑和血管形成，调节肿瘤的生长、转移和免疫逃逸，发挥促瘤活性[14-16]。肿瘤微环境各种生物信号促使巨噬细胞向M2型分化倾斜，抑制机体抗肿瘤免疫，从而促进肿瘤的恶性进展。

本研究结果显示，癌组织中可见核大、核仁明显及形态不规则的癌细胞，排列成巢状，索间有丰富的血窦，提示肝细胞癌高度恶性的特点。本研究结果显示，肝细胞癌组织中巨噬细胞标志物CD68、M1型巨噬细胞标志物S100A9和M2型巨噬细胞标志物CD163均高表达，而远端肝组织中仅有少量表达；肝细胞癌组织中的巨噬细胞主要以M2型(促瘤型)为主。这与已有研究结果一致[17]。巨噬细胞的极化呈现出动态变化的特点，其极化过程受到不同信号通路的调控[18]。IL-33/ST2信号通路作为肝脏免疫损伤的重要“警报器”激活后，诱导分泌IL-5、IL-13等Th2细胞相关因子，这些IL-5、IL-13等抗炎介质，进一步促进巨噬细胞向M2型极化，抑制机体的炎症反应、促进新生血管生成和调控T细胞引起的免疫反应，从而促进肝脏疾病的恶性进展[19]。本研究结果显示，与远端肝组织相比，肝细胞癌组织中IL-33、ST2的表达量明显上调，并与M2型巨噬细胞标志物CD163的表达呈明显的正相关，提示IL-33/ST2信号通路在肝细胞癌肿瘤微环境中参与巨噬细胞向M2型极化，抑制机体炎症反应和免疫反应，从而促进肝细胞癌恶性进展。进一步分析CD68、CD163、S100A9、IL-33、ST2等指标在肝细胞癌组织的表达与临床指标之间的相关性发现，M2型巨噬细胞的表达与肝细胞癌分化程度之间呈正相关，提示M2型巨噬细胞标志物Cd163可作为判断肝细胞癌分化程度的病理学标志。

综上所述，肝细胞癌组织中M2型巨噬细胞和IL-33、ST2的表达均上升，且具有相关性，提示IL-33/ST2信号通路参与肝细胞癌中巨噬细胞向M2型极化的过程。随着对肿瘤微环境和IL-33/ST2信号通路认识的进一步加深，研究巨噬细胞极化的机制具有深远意义，靶向IL-33/ST2信号通路可逆转巨噬细胞向M2型极化的过程，有望成为肝细胞癌免疫治疗的新靶点。