广西主要植烟区青枯病菌与黑胫病菌鉴定及混发情况初探

王五权，张得平，彭丽娟，孔 菲，孙成龙，桑维钧，卢燕回，杨茂发

(1.中国烟草总公司 广西壮族自治区公司，广西 南宁 530022；2.贵州大学 烟草学院，贵州 贵阳 550025；3.贵州中医药大学 基础医学院，贵州 贵阳 550025)

烟草青枯病是由青枯劳尔氏菌(R.solanacearum)引起的一种土传病害[1]。是一种高温高湿型病害，温度和湿度是病害发生和流行的先决条件。青枯病发病最适宜的温度为30～35 °C。湿度是影响该病发病流行的另一重要因素，我国南方夏季温度高、雨量多、湿度大，导致青枯病发展快，为害较重。烟草青枯病在苗期和大田期均可发病，作为典型的维管束病害，根、茎、叶均可受害，但以根、茎危害为主，烟株一旦染病常造成整株死亡，严重危害烟草生长和品质，造成产量和质量的毁灭性损失，严重阻碍烟草种植业的进一步发展[2-3]。

烟草黑胫病是世界烟草生产中危害最严重的病害之一，同时也是我国烟草主要土传病害，其病原为烟草疫霉(P.nicotianae)[4]，该菌可为害烟草整个生育期，尤其是移栽后的大田烟株，侵染烟茎基部，发病初期在茎基部形成黑斑，条件适宜时，黑斑向上扩展，直至全株腐烂，病部布满菌丝和孢子囊并传染附近烟株。烟草黑胫病也属高温高湿型病害，最适发病温度为24.5～32 °C，而且病株上产生的孢子囊和游动孢子借雨水或灌溉水、带菌的土壤、粪肥传播[5]。烟草黑胫病菌以卵孢子、厚垣孢子和菌丝体随病株残体在土壤中越冬[6]。该病在烟田易发生蔓延，破坏性极强，对烟草生产造成严重影响。

烟草黑胫病和青枯病均属于高温高湿病害，发病条件相近，故经常混合发生，危害十分严重，且难以防治，常对烟田造成毁灭性破坏，而且两种病原菌有很强的越冬能力，一旦二者成功定殖烟田，会造成烟田多年无法种植烟草。广西壮族自治区地处长江以南，属亚热带季风气候，气候温暖，雨量充沛，适宜烟草种植，成为全国最具发展种植优质烟叶潜力的产区之一[7]，得天独厚的自然条件为生产优质烟叶提供了良好的气候条件，但同时也利于烟草青枯病和黑胫病的发生及流行，烤烟是广西的主要经济作物之一，种植面积约1700 hm2，是农民脱贫致富的主要经济来源，随着烟田连作年限的延长，烟草青枯病和黑胫病近年来发生普遍，严重影响烤烟的产量和品质，已经是限制烤烟发展的重要障碍。本研究对广西烤烟主产区病害进行调查，明确现阶段引起广西烟草主要病害的种类、分布以及危害程度，为掌握烟草病害的发生发展规律和制定合理有效的防治措施奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试标本采集

2021年5～6月，于广西贺州、百色及河池等3市主要烟区采集具有典型烟草青枯病、黑胫病症状的标本，具体地点见表1。每块发病烟田至少采集3株病株。

1.2 试验方法

1.2.1烟草青枯病菌分离和鉴定

分离方法：选取新鲜的发病植株，从茎部的病健结合处切取少量组织，先以灭菌水清洗2～3次，在超净工作台晾干磨碎后加入10 mL灭菌水。28 °C、200 r/min 培养30 min。分别采用组织分离法、病株根围土壤样品平板梯度稀释法[8]和直接菌液稀释法等3种方法分离烟草青枯菌，所用培养基为参照刘艳霞[9]的方法配制改良的牛肉膏蛋白胨培养基，该培养基加入多种抑制真菌和放线菌的抗生素以及TTC，因此只能分离出致病性细菌，且致病性越强，菌落颜色越深。

快速鉴定方法：分别将青枯病菌单菌落挑取到液体培养基中进行培养，30 ℃，220 rpm，培养3～4 h后进行多重菌落PCR。利用NCBI Primer-BLAST 在线设计16SrDNA、speI和rpsS基因的部分序列的保守区片段引物，为快速检测，控制扩增片段长度在1000 bp以下，16SrDNA-f:ACTAACGAAGCA GAGATGCATTA，16SrDNA-r:CCCAGTCACGGCAG AGACT，speI-f:GTCGCCGTCAACTCACTTTCC，speI-r:GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG，rpsS-f:GATCG TCAAACCGATGAAGTC，rpsS-r:GATATGAC TCGTTCCGCAAAA。用高效扩增酶和快速扩增程序，扩增16SrDNA、speI和rpsS基因的部分序列，扩增结果经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，进行测序分析，结果在Genebank中进行序列比对。

1.2.2烟草黑胫病菌分离和鉴定

分离方法：参考郑小波[10]的方法，选择典型病株(图1)切取烟株茎基部病健交界组织，剪成小块，表面消毒后，置于燕麦培养基平板(参考方中达[11])上，28 ℃培养2～4 d后，根据菌丝形态进行分离纯化并保存。

鉴定方法：纯化后的烟草黑胫病菌，采用CTAB 法[12]提取总基因组DNA，PCR扩增部分ITS序列，扩增程序参考Pascual[13]的方法，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测后测序，测序结果在Genebank中进行序列比对。

2 结果与分析

2.1 烟草青枯病、黑胫病混合发生情况初探

从广西12个主产烟区采集烟草青枯病和黑胫病标本共116余份。结果发现，不同烟区烟草青枯病和黑胫病发生情况存在差异。河池市南丹县六寨镇采集标本2次，5月22日采集的标本发现烟草黑胫病与青枯病混合发生；6月13日未采集到烟草黑胫病与青枯病标本；河池市南丹县八圩乡采集的标本从外部症状上看为烟草青枯病，带回实验室纵剖感病烟株后发现部分为烟草黑胫病与青枯病混合发生。百色市隆林县德峨镇、蛇场乡采集的标本均为烟草黑胫病，未采集到烟草青枯病标本。

表1 烟草青枯病、黑胫病标本采集时间地点

靖西市新甲乡、地州镇、鲁利镇和同德乡等4个乡镇采集的标本有的仅发生烟草青枯病，有的烟草黑胫病和烟草青枯病混合发生。贺州市钟山县公安镇，富川县福利镇和葛坡镇采集的标本以烟草青枯病为主，有的烟草黑胫病和烟草青枯病混合发生。

从靖西市新甲乡、地州镇、鲁利镇和同德乡等4个乡镇，隆林县蛇场乡和德峨镇，南丹县八圩乡和六寨镇，钟山县公安镇，富川县福利镇和葛坡镇等乡镇烟田采集的标本中随机选取24株发病烟株观察症状，从症状上判断，烟草黑胫病和烟草青枯病混合发生的病株有13株(54.17%)，以靖西市新甲乡、地州镇和鲁利镇，钟山县公安镇，富川县福利镇和葛坡镇等地混合发生情况最为普遍(图1)。

图1 烟草青枯病与黑胫病混合发生的病株Fig.1 Tobacco bacterial wilt co-infection with black shank in Guangxi

2.2 烟草青枯病菌、黑胫病菌分离

从广西12个主产烟区采集116份标本，分离到烟草青枯病菌103株，烟草黑胫病菌13株。

将青枯病发病烟株近根茎部横切，切开后可见维管束已病变，颜色变为黑褐色、黑色。静置10 min后，发病较轻的有少许白色或微黄色菌液溢出；发病严重的，表皮和木质部间溢出白色或微黄的菌液。青枯病菌在筛选培养基上，菌落为圆形，稍隆起，菌落中央呈红色有光泽，周围红色稍浅，流动性较强，呈典型的青枯雷尔氏菌菌落形态(图2-a)。

注：a为筛选培养基分离青枯菌；b为燕麦培养基分离黑胫病菌。图2 烟草青枯病菌与黑胫病菌菌落形态Fig.2 Colony of R.solanacearum and P.nicotianae on media

纵剖黑胫病茎秆，可见髓部变为黑褐色，干缩呈碟片状，碟片之间有白色菌丝。烟草黑胫病菌在燕麦培养基上气生菌丝生长旺盛，呈白色絮状，菌落质地均匀(图2-b)。

2.3 烟草青枯病菌的鉴定

采用多重PCR技术对分离的青枯菌进行菌落PCR。结果表明：103株菌均可同时扩增得到大小分别为500 bp部分16S rDNA 序列、281 bpspeI基因的部分序列和180 bprpsS基因的部分序列的特异性扩增片段，将扩增的DNA片段切胶回收后测序，将测序结果在Genbank中比对，发现103株细菌均为青枯劳尔氏菌(R.solanacearum)。

2.4 烟草黑胫病菌的鉴定

显微镜下观察黑胫病菌丝粗细不均匀，有菌丝膨大体，在膨大体上常有若干放射状菌丝，厚垣孢子球形，顶生，孢子囊梨形(图3-a)。将纯化后的烟草黑胫病菌提取总DNA，PCR扩增部分ITS序列，进行琼脂糖凝胶电泳(图3-b)，将PCR产物测序后，结果在Genebank中进行序列比对，结果表明，测序菌株均为烟草疫霉(P.nicotianae)。

注：a为烟草疫霉厚垣孢子和孢子囊; b为部分烟草黑胫病菌ITS片段凝胶电泳结果。图3 烟草黑胫病菌鉴定Fig.3 Identification of tobacco P.nicotiana

3 结论与讨论

田间采集带回的标本，将烟株根茎部横切后，分为3种类型：以青枯病症状为主，以黑胫病症状为主，青枯病与黑胫病混合发生为主。烟草青枯病和黑胫病均为烟草土传性病害，病株根茎相交处都可呈黑色坏死症状，田间常见两种病害混合侵染。烟苗移栽期因外力扯拉易造成烟草根系损伤，病田残留病菌易侵染烟苗，如先感染其中一种病害，都可能导致容易感染其他病害并加重为害[14-15]。

广西烟区夏季高温多雨的气候条件适合生产优质烟叶，同时也适宜青枯病和黑胫病的发生与流行，容易造成大面积发病。通过调查，基本掌握了广西主要植烟区烟草青枯病与黑胫病发生为害情况，隆林县蛇场乡和德峨镇以烟草黑胫病为主，南丹县六寨镇与八圩乡烟草青枯病与黑胫病混合发生，但较靖西市、富川县和钟山县发病轻，其他烟区烟草黑胫病和青枯病均存在普遍复合侵染现象。不同县之间烟田发病有一定差异，导致这些差异的原因除了不同地区的生态条件和环境因素外，烟田不同的耕作和管理模式差异也是重要原因。研究表明[16-19]，土壤中微生物种类间的竞争和繁殖是影响烟草青枯菌危害程度的重要因素。作者认为，科学的耕作方式与合理施用农药在一定程度上可减轻两种病害的大面积发生，针对广西特殊的气候条件和栽培管理模式，还可采用病原菌早期快速检测、培育抗病品种和研制新型农药等措施。

结合烟田病害调查与实验室分离鉴定结果发现，在广西主要植烟区青枯病与黑胫病混合发生较普遍。两种病害均可破坏维管束组织，从而导致烤烟水分和营养物质输送功能受损，进一步破坏烟叶的品质和产量。病害防治药剂如不能有效输送至发病部位，或药剂使用不当易造成药害或病原的抗药性，而且多年烤烟连作使得感病程度加剧，对烟草青枯病和黑胫病的预防和治理带来较大困难。因此，生产中可考虑同时或先后施用防治烟草青枯病与黑胫病的药剂，减轻这两种病害的危害。

生物防治通过与病原菌竞争营养和空间位点、分泌抑菌物质、诱发植物抗病潜能等直接或间接地抑制或杀死病原菌。因此，探索和研发生防产品对烟草根茎类病害的防治显得尤为重要。目前已经有报道链霉菌能够应用于烟草黑胫病的生物防治[20]，通过盆栽试验证实枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌能够用于烟草青枯病的生物防治[21]，在烟草种植过程中，由于只能在移栽期前将生防菌施用大田，因而实行提前防治才能使得生防菌成功定殖，占领生态位、分泌抑菌物质或代谢产物。

对于广西主要烟草种植区，早诊断和早鉴定在青枯病防治中很重要。将PCR技术应用于青枯病诊断及病原菌鉴定等方面国内外已有报道。而本研究先利用改良后的筛选培养基筛选烟草青枯菌，将活化后的菌液作为扩增的模板，再利用多个保守特异性片段引物进行多重PCR技术进行进一步鉴定，既简化试验步骤缩短检测时间，又可减少土壤中其他微生物干扰。本研究中无论是青枯病发生较重的烟杆，还是发病初期的烟株，均通过这种方法成功分离到烟草青枯菌。因此，选择性培养基和多重菌落PCR技术的联合使用是一种检测青枯病菌的有效方法，为鉴定烟草青枯病菌株提供了一种快速特异的检测手段。