HS-SPME-GC-MS法测定川藏道地药材手掌参挥发性成分

杨秋悦,徐立军,杨 洋,罗影子,黄明进

(1.西藏藏医药大学,西藏 拉萨 850000；2.贵州大学 农学院/石斛研究院/贵州省药用植物繁育与种植重点实验室,贵州 贵阳 550025)

手掌参为兰科植物手参(Gymnadeniaconopsea(L.)R.Br)的干燥根,因其地下根茎形似手掌而得名手掌参[1],又名藏三七、掌参、佛手参、手儿参或旺拉。在中国主要分布在四川、西藏、青海等地,除中国外,朝鲜半岛、日本、俄罗斯、西伯利亚及欧洲一些国家均有分布[1]。手掌参具有补益气血、生津止渴的功效,主治肺虚咳喘、虚劳消瘦和神经衰弱等,中医临床用于补肾益精、生津止渴、消瘀和理气止痛[2]。此外,手掌参具有抗过敏、抗氧化作用[3]以及促进祖细胞增殖的作用[4]。固相微萃取拥有简单便捷、费用较少、易于自动化等特色,且在萃取过程中不需要有机溶剂,可以和气相色谱—质谱(GC-MS)直接联用,具有集采样、萃取、浓缩及进样于一体的优点,被广泛应用在农业[5]、食品和环境[6-7]等领域中。前人对手掌参的研究主要集中在其营养成分(糖、脂肪、蛋白质、粗纤维等)与药用活性(抗氧化活性、延缓衰老等),目前还未有人对其挥发性成分进行研究,手掌参具有明显的气味,证明其挥发性成分含量较丰富,对此进行研究能更好的开发利用手掌参药材,本试验对7个(批)手掌参进行了挥发性成分的初步研究。采用顶空固相微萃取技术(HS-SPME)萃取手掌参药材中的挥发性成分,利用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对不同产地手掌参中的挥发性成分进行快速的定性、定量分析,采用主成分分析和聚类分析方法对获得的数据进行统计,为了解手掌参药材挥发性物质组成、评价药材质量提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用手掌参样品由西藏藏医药大学徐立军教授采购并鉴定为兰科植物手掌参(G.conopsea)的干燥根。共7个(批)样品,按地理位置,自西向东分别采自西藏朗县(Z1：经度93°40′,纬度29°30′)、西藏米林(Z2：经度94°13′,纬度29°13′)、西藏波密(Z3：经度95°45′,纬度29°52′)、西藏昌都(Z4：经度97°10′,纬度31°90′)、四川巴塘(Z5：经度99°60′,纬度30°00′)、四川理塘(Z6：经度100°16′,纬度30°00′)、四川阿坝(Z7：经度101°42′,纬度32°54′)。

1.2 试验仪器

手动SPME进样手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex萃取头(美国 Supelco公司)、HP6890/5975C GC-MS联用仪(美国安捷伦公司)、电子天平(JA2003N,上海菁海仪器有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1顶空固相微萃取(HS-SPME)

将不同产地手掌参粉碎后过40目筛,称取混匀样品4.4～6.6 g,置于10 mL固相微萃取仪采样瓶中,插入装有2 cm50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纤维头的手动进样器,在65 ℃的平板加热条件下顶空萃取60 min后,移出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口(温度250 ℃)中,热解析进样。

1.3.2气相色谱—质谱(GC-MS)分析

GC条件：色谱柱为Agilent HP-5MS(60 m×0.25 mm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱,初始温度50 ℃(保留2 min),以3.5 ℃/min升温至160 ℃,再以10 ℃/min升温至310 ℃,运行时间48.43 min；汽化室温度250 ℃；载气为高纯He(99.999%)；柱前压16.79 psi,载气流量1.0 mL/min,不分流,溶剂延迟时间3 min。

MS条件：离子源为EI源；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA；倍增器电压1635 V；接口温度280 ℃；质量范围29～500 amu。

1.4 挥发性化合物定性定量分析

对总离子流图中的各峰经质谱计算机数据系统检索及核对Nist17和Wiley275标准质谱图,确定挥发性化学成分,用峰面积归一化法计算了各化学成分的相对质量分数。

1.5 统计学处理

采用SPSS 21.0软件对不同产地手掌参样品挥发性成分进行主成分分析[8-9]和聚类分析[10]。

2 结果与分析

2.1 HS-SPME-GC-MS结果分析

按1.4操作,得到7个(批)手掌参药材挥发性成分总离子流图(图1)。采用峰面积归一化法对挥发性成分进行分析,计算各挥发性成分在不同样品挥发性成分中的相对百分含量,结果见表1。7个(批)手掌参药材样品共有成分为20种,其含量差异较大(表1)。不同样品中检测到的挥发性成分种类最少为28个,最多为60个(其中有3个成分未鉴定出是何物质),其成分类型主要为醛、醇、酮、酸、烷烃等。朗县产地的手掌参样品检测出60种成分,其中1个成分未知；米林产地的手掌参样品检测出34种成分,其中1个成分未知；波密产地的手掌参样品检测出28种成分,其中1个成分未知；昌都产地的手掌参样品中检测鉴定出38种成分；巴塘产地的手掌参样品检测出37种成分,其中1个成分未知；理塘产地的手掌参样品检测出34种成分,其中1个成分未知；阿坝产地的手掌参样品检测出36种成分,其中1个成分未知。

注：a表示西藏朗县；b表示西藏米林；c表示西藏波密；d表示西藏昌都；e表示四川巴塘；f表示四川理塘；g表示四川阿坝。图1 不同产地手掌参挥发成分总离子流图Fig.1 Total ion flow diagram of volatile components of G.conopsea from different producing areas

表1 不同产地手掌参样品挥发性成分

续表1

2.2 对挥发性成分进行主成分分析

将数据进行主成分分析(PCA),由于变量太多,样本量太少,无法构成正定矩阵,因此对其变量因子进行筛选,最终用茴香醚、壬醛、1-甲氧基-4-甲基-苯、邻苯二甲酸二丁酯、乙酸、己醛6个挥发性成分建立7×6矩阵。将数据导入SPSS 21.0软件,经降维因子分析后,提取特征值大于1的,只有2个主成分,且方差贡献率小于80%,故手动提取3个主成分,累计方差贡献率为89.94%(>85 %),可以反映不同产地手掌参样品挥发性成分的大部分信息(表2)。通过因子载荷矩阵中主成分负荷向量计算因子得分系数,因子得分系数=矩阵各主成分负荷向量/各主成分特征值的平方根,表示各项指标变量与提取的公因子之间的关系(表3),在某一公因子上得分高,表明该指标与该公因子之间关系越密切。

由表3可得到,3个主成分的因子评价线性关系：

F1= 0.231X1-0.147X2-0.257X3+0.263X4-0.173X5+0.211X6

F2= -0.504X1-0.574X2+0.177X3+0.125X4+0.336X5+0.486X6

F3= 0.078X1+0.628X2-0.192X3+0.326X4+0.724X5+0.308X6

由上述公式算出各成分的F1、F2、F3值,综合得分F由每个主成分对应的特征值占所提取主成分总特征值之和的比例作为权重计算主成分综合模型：F=0.58565F1+0.17026F2+0.14344F3,见表4,计算因子得分可对样本进行比较。

表4 不同产地手掌参样品的主成分因子得分Tab.4 Principal component factor scores of G.conopsea samples from different origins

从表4中F因子值可知,手掌参的药材质量为Z7>Z6>Z2>Z3>Z4>Z1>Z5,即四川阿坝>四川理塘>西藏米林>西藏波密>西藏昌都>西藏朗县>四川巴塘,此结果基于提取茴香醚、壬醛、1-甲氧基-4-甲基-苯这3个成分代表手掌参挥发性总成分基础上得出。

2.3对挥发性成分进行聚类分析

运用 SPSS 21.0 软件,采用 Ward′s 聚类法,以Euclidean 距离为测度,以12个成分(乙醇、乙酸、己醛、2-戊基-呋喃、2-乙基己醇、对甲酚、3,4-二甲氧基甲苯、1-甲氧基-4-甲基-苯、茴香醚、邻苯二甲酸二丁酯、E-2-辛烯醛、壬醛)为主要变量,对7个不同产地的手掌参样品进行了聚类分析,结果如图2所示。当欧氏距离为10时,7个样品被聚为2类,产地为西藏米林、西藏波密、西藏昌都、四川巴塘、四川理塘、四川阿坝的聚为1类,产地为西藏朗县的单独聚为1类；当欧式距离为5时,7个样品被分为3类,产地为西藏昌都、西藏米林、西藏波密、四川巴塘的聚为1类,产地为四川阿坝和四川理塘的聚为1类,产地为西藏朗县的单独聚为1类。由此可看出西藏朗县所产的手掌参与其他产地的有明显差异,在挥发性成分测定中此样品挥发性成分最多,且有多个其他产地没有检测出的成分。根据地理位置判定,7个产地中,朗县最靠近西边,与其他产地的手掌参有明显的差异,故而根据经度差异,可简单分为94°E以西为一类,94°E以东为一类。西藏昌都和四川阿坝分属于不同两个省级行政区,但由于处在川藏交界,且经度相近,故2个手掌参样品有很大相似性,可知手掌参的挥发性成分受地域影响大。

图2 7个不同产地手掌参样品的聚类分析Fig.2 Cluster analysis of seven G.conopsea samples from different origins

3 结论与讨论

采用HS-SPME-GC-MS法对来自川藏7个(批)不同产地手掌参样品的挥发性成分测定分析,共测定出70个成分,其中3个成分未能确定其构成,共有成分有20个,其中含量最多的是对甲酚,含量在57%～81%之间,其次为茴香醚和己醛,两者差异不大,无法作为分辨指标。本试验对手掌参药材评价根据主成分分析,提取茴香醚、壬醛、1-甲氧基-4-甲基-苯这3个成分进行降维分析,得出四川阿坝>四川理塘>西藏米林>西藏波密>西藏昌都>西藏朗县>四川巴塘这一结果,但由于样品来源少且没有同一产地不同批次的样品,故此结果具局限性,只是对手掌参样品挥发性成分的初步研究。日照是植物进行光合作用的必要条件,日照时数可能通过影响挥发性成分前体物质的供给而对挥发性成分的合成产生影响[11-12]。低温或高温会对植物细胞膜系统的稳定性造成破坏并诱导活性氧积累,从而诱导萜类、酚类等具有清除自由基等功能的次生代谢物的合成[13]。前人研究证明挥发性成分受日照、气候等环境因子影响大,故测定结果具不稳定性。

与兰科植物相比,手掌参与石斛花含有的相同挥发性成分有：己醛、苯甲醛、苯甲醇、壬醛、十四烷、十五烷、庚醛、2-庚酮、(Z)-2-庚烯醛、2-戊基呋喃、(E)-2-辛烯醛[14-16]；与天麻含有的相同挥发性成分：2-庚酮、苯甲醛、1-辛烯-3-醇、2-戊基呋喃、3-辛烯-2-酮、苯乙醛、庚醛、对甲酚、十五烷、十六烷、乙酸、己酸、戊醛[17-18]；与白芨花含有的相同挥发性成分：1-辛烯-3-醇、苯甲醇、戊醛、己醛、庚醛、壬醛、苯甲醛、十五烷、十六烷、对甲酚[19]。可见,在兰科植物的挥发性成分中,有许多共有成分,且多数为醛、酮类物质。

在这些挥发性成分中,对甲酚用于制染料、消毒药、药品、树脂和增塑剂等[20]；茴香醚具有令人愉快的茴香样香气,用于有机合成,也用作溶剂、香料和驱虫剂[21]；壬醛为无色油状液体,具有玫瑰、柑橘等香气,有强的油脂气味[22]；己醛可用于调配苹果、橙子、浆果、西瓜等食用香精[22]；邻苯二甲酸二丁酯为增塑剂,对多种树脂具有很强溶解力[23],由于手掌参含有这些成分故而其具有很浓厚且混合的味道。

试验结果显示川藏不同产地的手掌参有多种相同化学成分但含量差异大,由于挥发性成分受环境影响大,故在评价其品质时,应全面考察其指标成分,未来还可测定其他省份的手掌参样品挥发性成分,以及不同收获季节即不同批次的手掌参样品进行更加深入的研究。