基于网络药理学及分子对接技术探究天山花楸抗哮喘的作用机制

吴 娜，屯妮萨古丽·艾买提江，李改茹

(新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830017)

天山花楸(SorbustianschanicaRupr.)为蔷薇科花楸属植物，是新疆民间常用药材，常以嫩枝叶、果实和茎皮入药，主要包括黄酮类、糖类、氰苷类、氨基酸、蛋白质、微量元素、有机酸、生物碱、挥发油等[1-2]，具有清热利肺、补脾生津、止咳的功效，主要用于肺结核、哮喘咳嗽、胃炎及维生素A、C缺乏等症的治疗[3]。哮喘是呼吸道常见疾病，其发病涉及多种机制[4]，目前尚未完全明确。研究发现，中医药疗法在哮喘治疗中存在明显优势，中药可以调节免疫细胞的功能，进而改善气道炎症，减轻哮喘症状，并且中药具有安全性高、副作用小等多种优点，可以替代或辅助西药治疗哮喘[5]。本课题组前期研究发现天山花楸水提物可明显延长豚鼠的引喘潜伏期，并能使正常豚鼠的离体气管平滑肌明显松弛[6]，天山花楸醇提液还可拮抗豚鼠离体平滑肌收缩，具有平喘作用[7]，但是其发挥抗哮喘活性的物质基础及作用机制并不明确。本研究基于网络药理学和分子对接技术，初步探究天山花楸抗哮喘的作用靶点及通路，为深入研究其作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1活性成分的筛选及其靶点的预测根据课题组前期实验结果建立天山花楸化合物库，从PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库获取了化合物的SMILES信息，并将其导入SwissTargetPrediction平台(http://www.swisstargetprediction.ch/)对候选化合物的OB和DL进行预测。要求必须同时满足胃肠吸收(GI absorption)为“High”、5种类药性预测(Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge)中有2个或2个以上为“Yes”，才能筛选为活性成分[8]。通过TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)数据库和BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)数据库收集天山花楸活性成分可能的作用靶点[9]。应用Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)对目标基因的名称进行名称规范并转换为简写，删除无相应基因名称的靶点。

1.2疾病靶点的获取以“Asthma”为关键词在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、Herb数据库(http://herb.ac.cn/)和DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org/)[10]，进行检索，属性设置为“智人”，收集在3个数据库中筛选到的疾病靶点。

1.3蛋白质相互作用网络的构建将化合物和疾病的靶标分别上传到在线维恩图(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)中，取天山花楸靶点和哮喘靶点的交集，并将所获得的交集靶点上传到STRING 11.0数据库(https://string-db.org/)，物种设置为“智人”。删除游离靶标后，构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，将其导入Cytoscape3.9.1中进行网络可视化，并利用CytoNCA插件进行核心靶点分析，得到PPI网络。

1.4GO和KEGG富集分析通过RStudio (version 1.4.1103 for Windows)软件对PPI核心靶点进行GO生物学功能富集分析和KEGG信号通路富集分析。为进一步研究，将前20个KEGG信号通路及化合物相关靶点通过Cytoscape构建可视化网络。

1.5天山花楸“靶点-通路”网络的构建根据KEGG通路富集分析的前20条通路，和相应的核心靶点建立相互作用联系，构建“靶点-通路”网络可视化图。

1.6分子对接分子对接前处理：分别从PDB数据库(http://www.rcsb.org/)和Pubchem数据库下载核心靶点和活性成分的三维立体结构。利用Open Babel软件(http://openbabel.org/wiki/Main_Page)将化合物的SDF格式转换为MOL2格式。下载的蛋白质用AutoDock Tools进行脱水、加氢预处理后，进行化学成分与靶点蛋白的分子对接。采用Pymol对分子对接结果进行可视化分析。

2 结果

2.1活性成分筛选及靶点筛选通过SWISS ADME数据库对化合物进行ADME筛选，共筛选出17个活性成分，见表1。根据TCMSP数据库和BATMAN平台预测靶点，BATMAN平台设置“药物-靶标”间相似性得分Score cutoff≥20，AdjustedP-value<0.05，收集靶点，最后合并2次检索信息，删除重复值，共获得810个靶点。

表1 天山花楸活性成分

2.2药物作用靶点的筛选利用GeneCards、Herb和DisGeNET数据库，以“Asthma”为关键词筛选疾病靶点。将药物靶点与疾病靶点分别上传到在线维恩图中取交集，得到天山花楸作用于哮喘的靶点240个，见图1。

2.3PPI网络拓扑分析将获得的240个交集基因上传到STRING 11.0数据库，构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，通过CytoNCA插件进行分析，得到该网络度值Degree平均数为14.272 727，节点紧密度Betweenness平均数为385.318 182，节点介度Closeness平均数为0.375 086 1。筛选出Degree、Betweenness值大于两倍平均数、Closeness大于平均数的的靶点作为核心靶点，共19个，核心靶点PPI网络图见图2。

2.4GO、KEGG富集分析GO功能分析结果显示：共涉及1 876个生物过程(BP)、59个细胞组分(CC)和110个分子功能(MF)。各筛选前10条以条形柱状图展示，见图3。生物过程主要富集在胶质细胞分化(glial cell differentiation)、化学应激的细胞反应(cellular response to chemical stress)、胶质发生(gliogenesis)、氧化应激的细胞反应(cellular response to oxidative stress)、DNA-结合转录因子活性的调节(regulation of DNA-binding transcription factor activity)、氧化应激的反应(response to oxidative stress)、上皮细胞增殖(epithelial cell proliferation)等。细胞组分主要富集在转录调控复合物(transcription regulator complex)、RNA聚合酶II转录调控复合物RNA(polymerase II transcription regulator complex)、细胞基底部(basal part of cell)、膜筏(membrane raft)、膜微区(membrane microdomain)、膜区(membrane region)、核常染色质(nuclear euchromatin)，分子功能主要富集在激活转录因子结合(activating transcription factor binding)、磷酸酶结合(phosphatase binding)、蛋白磷酸酶结合(protein phosphatase binding)、组蛋白去乙酰化酶结合(histone deacetylase binding)等。KEGG通路富集分析结果表明，共有142条信号通路，筛选出前20条通路以气泡图进行展示，见图4。结果显示天山花楸干预哮喘主要涉及白介素17(interleukin-17，IL-17)、Toll样受体、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)、Th17细胞分化、HIF-1等信号通路。

2.5天山花楸“靶点-通路”网络的构建根据KEGG通路富集分析的前20条通路，和核心靶点建立相互作用联系，将靶点、信号通路通过Cytoscape3.9.1软件进行可视化，结果如图5所示，核心靶点用橙色节点表示，通路用绿色节点表示，度值越大，节点的形状越大，根据拓扑分析结果表明RELA、AKT1、IL6、TNF、JUN、FOS可能是天山花楸治疗哮喘的主要作用靶点。

2.6分子对接结果前期实验结果表明天山花楸乙酸乙酯提取物具有抗哮喘活性，并且其发挥抗哮喘作用的物质可能是黄酮类、酚类、苯丙素类及氰苷类化合物，如槲皮素、绿原酸、没食子酸、苦杏仁苷等。网络药理学结果表明其发挥抗哮喘作用的关键靶点可能是RELA、AKT1，将这两个靶点分别与槲皮素、绿原酸、没食子酸、苦杏仁苷进行分子对接，观察化合物与靶点的结合能力。结果显示，槲皮素通过8个氢键与AKT1蛋白结合，结合能为-6.18 kcal/mol，槲皮素通过8个氢键与RELA蛋白结合，结合能为-5.91 kcal/mol，绿原酸通过5个氢键与AKT1蛋白结合，结合能为-3.46 kcal/mol，绿原酸通过4个氢键与RELA蛋白结合，结合能为-2.15 kcal/mol，没食子酸通过5个氢键与AKT1蛋白结合，结合能为-3.48 kcal/mol，没食子酸通过6个氢键与RELA蛋白结合，结合能为-2.76 kcal/mol，苦杏仁苷通过9个氢键与AKT1蛋白结合，结合能为-2.48 kcal/mol，苦杏仁苷通过5个氢键与RELA蛋白结合，结合能为-1.64 kcal/mol。结合能小于-1.2 kcal/mol时认为结合良好，见表2。分子对接结果表明槲皮素、绿原酸、没食子酸、苦杏仁苷均能与AKT1和RELA良好结合，见图6。

表2 成分与关键靶点分子对接结果

3 讨论

基于网络药理学和分子对接技术对天山花楸的抗哮喘作用机制进行了初步探讨，结果表明天山花楸抗哮喘作用可能与AKT1、EGFR、TP53、TNF、JUN、IL-6、HSP90AA1、RELA、MAPK1、IL-1β等靶点有关，并且可能通过白介素17、肿瘤坏死因子、Toll样受体、Th17细胞分化、HIF-1等信号通路发挥抗哮喘作用。分子对接结果表明，天山花楸活性成分与抗哮喘活性靶点的结合能较低，具有较强的结合活性。

IL-17主要由CD4+T辅助细胞分泌并作用于Th17细胞，IL-17在哮喘气道中可以促进中性粒细胞浸润，诱发中性粒细胞性炎症反应，促进气道重塑[11]。TNF-α是哮喘发病过程中的重要炎症因子，可以激活诱发多细胞相互作用并使炎症持续发展，在TNF信号通路中，TNF-α可以激活MAPK/NF-κB[12-13]，同时可激活JNK信号通路[14]，JNK信号通路可以调控支气管平滑肌细胞增殖、凋亡等。Toll样受体激活可加剧气道炎症，未成熟的肺DC表达TLR，这些细胞在感染和炎症进程中被激活后导致共刺激分子上调、释放Th2细胞因子，导致EOS浸润，杯状细胞黏液分泌增多，引起慢性气道炎症[15]。缺氧是支气管哮喘患者中普遍存在的一种病理特征，在低氧条件下，缺氧诱导因子-1(Hypoxia inducible factor-1，HIF-1)可以激活VEGF信号通路，刺激气道重塑[16]。同时，HIF-1α在促炎因子如IL-1β的生成中也发挥关键作用[17]。

本研究通过网络药理学方法和分子对接技术，初步探究了天山花楸抗哮喘的作用机制，找到了多个潜在的作用靶点，为后续研究天山花楸抗哮喘的作用靶点及通路奠定一定的基础。