缺氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子在食管鳞癌组织中的表达及临床意义

刘新亚，刘英敏，范志勤，曾 敏

(1新疆医科大学附属肿瘤医院肿瘤心脏病科，2日间手术病房，3胸腹放射治疗科病区，乌鲁木齐 830011)

食管癌是常见的上消化道恶性肿瘤之一，发病率位居我国恶性肿瘤发病的第五位，死亡率位居第四位[1-2]。食管鳞癌(Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)占我国食管癌患者总发病数的90%以上，因患者早期症状不明显，70%的患者就诊时已发生局部浸润或远处转移[3]，5年生存率<20%[4]。因此提高食管鳞癌早期诊断的准确性，寻找有效生物学指标具有重要的临床意义。缺氧是许多实体肿瘤的共同特征，当肿瘤体积超过1 mm3时，会导致实体肿瘤发生缺氧[5]。缺氧诱导因子-1(Hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是介导缺氧反应的最重要的核转录因子，由α和β亚单位组成的异二聚体蛋白[6]。在缺氧条件下，HIF-1α因羟化作用而稳定，并转移到细胞核并发挥转录活性[7]，激活下游信号进而参与到肿瘤细胞的浸润或者扩散等过程。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管生成的关键调节因子，在许多不同类型的肿瘤中均可发现该因子表达异常[8]。Zhu等[9]研究发现，在缺氧环境下HIF-1可直接与VEGF启动子区的缺氧反应元件相结合，通过激活HIF-1 /VEGF信号通路直接驱动血管生成，参与恶性肿瘤的侵袭和转移。HIF-1和VEGF的高表达可预示肿瘤的预后不良[10]，但两者在食管鳞癌中的相关研究较少。本研究通过检测食管鳞癌中HIF-1α mRNA和VEGF mRNA的表达水平，分析两者表达与患者临床病理特征的关系，探讨HIF-1α和VEGF在食管鳞癌发生、发展中的作用，为临床诊断治疗提供理论基础。

1 资料与方法

1.1一般资料收集2019年9月-2019年12月就诊于新疆医科大学附属肿瘤医院胸外科食管癌患者手术切除的癌组织标本40例，同时取距癌组织边缘>5 cm处的正常组织标本作为癌旁组织。所有组织标本于离体30 min内取材，经生理盐水清洗后迅速放置液氮速冻，存放于-80℃冰箱中待检。所有组织标本病理明确诊断为食管鳞状细胞癌。40例食管鳞癌患者中，男性31例，女性9例，年龄45～71岁，平均年龄58.73±6.85岁。按照美国癌症联合会于2017年修订的肿瘤TNM(Tumor node metastasis classification)分期标准进行肿瘤临床分期[11]：Ⅱ期7例，Ⅲ期33例；肿瘤分化程度：中分化24例、低分化16例；淋巴结转移患者29例，无淋巴结转移患者11例。本研究通过新疆医科大学附属肿瘤医院伦理委员会批准(伦理编号：K-2019053)，标本采集前患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2纳入与排除标准[12]纳入标准：(1)临床、病理资料详细；(2)经病理诊断首次确诊为食管鳞癌；(3)均接受根治手术治疗；(4)术后标本切缘距肿瘤>5 cm；(5)患者签署知情同意书。 排除标准：(1)手术前接受过放、化疗治疗或靶向治疗；(2)转移性食管鳞癌患者；(3)合并其他恶性肿瘤。

1.3试剂与仪器Trizol试剂(美国Aambion公司,15596026)，逆转录试剂盒(美国ABM公司，G492)，PCR反应试剂(美国MasterMix-EL公司，2423583)。实时PCR仪(美国Bio-Rad公司)，荧光定量Real Time PCR instrument(美国ABI公司)，微量分光光度计(杭州奥盛仪器有限公司)。

1.4检测方法取食管鳞癌及癌旁组织标本分别放入液氮预冷的研钵中，研磨成粉末状后，加入1 mL的TRIzol，按TRIzol试剂说明书操作提取组织RNA，核酸蛋白定量仪检测RNA浓度，琼脂糖电泳检测RNA完整性。经检测在电泳图中，以28S与18S亮度较高，5S最弱或无条带，条带单一、完整可视为合格RNA样本，见图1。将提取的RNA 用逆转录试剂盒，以25℃ 10 min，85℃ 5 s的反应条件合成 cDNA。随后进行荧光定量PCR，荧光定量程序为： 95℃ 2 min预变性； 95 ℃反应5 s 变性，60℃ 反应30 s 退火/延伸，共40个循环，引物序列见表1。以GAPDH为内参，每组取3个复孔的均值，根据各样本的平均Ct值，以2-△△Ct计算mRNA相对表达水平。

表1 扩增引物序列

2 结果

2.1食管鳞癌及癌旁组织中HIF-1α mRNA和VEGF mRNA的表达情况在食管鳞癌组织中HIF-1α mRNA相对表达水平为1.207 6±0.339 1，高于癌旁正常组织的0.947 2±0. 161 9，差异有统计学意义(t=8.452，P<0.01)；VEGF mRNA在食管鳞癌组织中的相对表达水平为2.068 6±0.744 6，高于癌旁正常组织的1.064 7±0. 338 0，差异有统计学意义(t=5.400，P<0.01)，见图2。

2.2HIF-1α mRNA和VEGF mRNA表达与食管鳞癌临床病理特征的关系以食管鳞癌组织中HIF-1α mRNA和VEGF mRNA的平均表达水平为截断值，将患者分为HIF-1α高表达组、低表达组和VEGF高表达组、低表达组。HIF-1ɑ高表达与肿瘤大小(χ2=5.560，P=0.035)、分化程度(χ2=7.424，P=0.010)、脉管癌栓(χ2=6.825，P=0.016)、淋巴结转移(χ2=4.713，P=0.048)和TNM分期(χ2=5.683，P=0.033)有关；VEGF高表达与脉管癌栓(χ2=10.940，P=0.002)、淋巴结转移(χ2=6.040，P=0.014)和TNM分期(χ2=5.657，P=0.029)密切相关，患者的年龄、性别与两者表达强度无明显相关性(P>0.05)，见表2。

表2 HIF-1α mRNA和VEGF mRNA表达与临床病理特征的关系

2.3HIF-1α和VEGF表达在食管鳞癌组织中的相关性分析Pearson相关性分析显示，食管鳞癌组织中HIF-1α mRNA与VEGF mRNA表达强度呈正相关(r=0.747，P<0. 001)，见图3。

2.4HIF-1α和VEGF诊断食管鳞癌的效能分析将食管鳞癌组织与癌旁组织相比较，HIF-1α mRNA诊断食管鳞癌的曲线下面积(AUC)为0.774 4 ( 95%CI：0.670 0～0.878 8)，VEGF mRNA诊断食管鳞癌的曲线下面积为0. 928 8 (95%CI：0.877 6～0.979 9) ，见图4。

3 讨论

实体肿瘤的不断生长和扩张，导致肿瘤内的氧浓度降低，瘤体内HIF-1α与缺氧反应元件(HRE)结合，可转录60多种参与肿瘤发生发展过程的基因，来调节细胞对缺氧微环境的适应，其中包括血管生成、凋亡和增殖等[13]。在结肠癌、乳腺癌等恶性肿瘤中HIF-1α都呈不同程度阳性表达，而在正常组织中表达量较少，可作为恶性肿瘤的分子标志物[14-15]。本研究发现HIF-1α在食管鳞癌组织中表达水平明显升高，推测HIF-1α可能参与食管鳞癌的发生发展过程。Hu等[16]检测182例食管鳞癌患者中的HIF-1α表达情况，结果发现食管鳞癌组织中表达率为56.04%，癌旁组织表达率仅为9.89%，与本研究结果一致。同时本研究发现HIF-1α与肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移及临床分期有关，研究结果可佐证随着肿瘤体积的增大，肿瘤组织内部发生明显的缺血缺氧，增加HIF-1α的表达，HIF-1α高表达与食管鳞癌的恶性生物学行为有关。

VEGF是肿瘤血管生成的关键刺激因子，能促进内皮细胞分裂增殖、增加血管内皮通透性、刺激新生血管形成，从而促进肿瘤的生长、侵袭和转移，其异常表达与多种恶性肿瘤的不良预后相关[17]。本研究发现VEGF在食管鳞癌组织中高表达，VEGF高表达与脉管内瘤栓、淋巴结有转移及临床分期较晚有关，此结果与VEGF诱导脉管生成促进食管鳞癌发生远处转移的作用机制相吻合。Liu等[18]研究同样发现VEGF在食管鳞癌组织高表达，VEGF的高表达与患者的淋巴结转移及肿瘤分期较晚密切相关。据此说明VEGF在食管鳞癌的发生发展中发挥重要的作用。

缺氧条件下活化的HIF-1α对VEGF的表达进行直接调控，HIF-1α可介导VEGF mRNA的转录和激活，同时具有增强VEGF的稳定性的作用，进而提高VEGF的表的表达呈正相关关系，故推测两者在食管鳞癌发展中可能存在某种靶向调控关系，考虑肿瘤组织快速增殖造成微环境低氧状态达水平，促进肿瘤血管和淋巴管生成，HIF-1和VEGF在肿瘤的发生发展过程中可发挥协同促进作用[9]。本研究发现HIF-1α和VEGF的表达呈正相关关系，故推测两者在食管鳞癌发展中可能存在某种靶向调控关系，考虑肿瘤组织快速增值造成微环境低氧状态，为适应低氧微环境HIF-1α被激活，上调VEGF的表达水平，促进肿瘤新生血管形成，最终促进食管鳞癌的侵袭和转移，但其具体作用机制需体外试验证实。吴旻等[19]通过对79例食管鳞癌患者研究发现HIF-1α和VEGF在食管鳞癌组织的表达水平明显高于癌旁组织，并与食管鳞癌临床病理特征密切相关；同时两者表达达呈正相关，与本研究结果一致。本研究通过诊断实验发现HIF-1α和VEGF对食管鳞癌的诊断具有一定的价值，可为食管鳞癌的早期诊断提供一定的参考意义。

综上所述，HIF-1α mRNA和VEGF mRNA在食管鳞癌组织中表达水平增高，两者表达呈正相关，且两者对食管鳞癌的基因诊断有一定的准确性，可作为诊断食管鳞癌的有效分子标志物。但本研究也存在一定的局限性，纳入样本量较少、未评估两个指标在食管鳞癌预后中的价值，后续将扩大样本量完善本研究，为食管鳞癌的诊治提供依据。