Fosl-1、β-catenin及Wnt蛋白在儿童肾母细胞瘤中的表达及临床意义

艾丽霞，海力其古丽·努日丁，王学梅，严 媚

(新疆医科大学第一附属医院，乌鲁木齐 830054)

肾母细胞瘤是儿童时期肾脏最常见的恶性肿瘤之一，占儿童肾脏肿瘤的90%，儿童发病率为1/100 000[1]。Fos样抗原1( Fosl-1)是Fos家族的成员之一，它参与了肿瘤增殖、分化和凋亡的控制，在各种类型的恶性肿瘤的发生中起着重要的作用[2]，包括肺癌[3]、骨肉瘤[4]、胰腺癌[5]、胃腺癌[6]、乳腺癌[7]等。Wnt信号通路是目前已知的胚胎发育所必需的信号通路, 经典Wnt信号转导通路致癌的关键是该途径任何一个信号分子异常导致β-连环蛋白(β-catenin)在细胞质/核内累积[8]。本研究拟通过检测肾母细胞瘤组织和癌旁组织中Fosl-1、β-catenin及Wnt蛋白的表达情况, 评价它们的异常表达与临床病理指标的关系, 同时对Fosl-1蛋白高表达与β-catenin、Wnt蛋白异常表达的相关性进行研究，旨在初步探讨Fosl-1、β-catenin及Wnt蛋白三者之间表达相关性与肿瘤转移之间的关系。

1 材料与方法

1.1研究对象本研究为回顾性研究。收集新疆医科大学第一附属医院病理科2012年1月—2019年1月手术切除肾母细胞瘤石蜡包埋标本57例，所有患者术前均未经过任何治疗且均有完整的临床病理及随访资料。57例肾母细胞瘤标本中，男性22例，女性35例，平均年龄为4岁。肿瘤直径<10 cm的31例，≥10 cm的26例；TNM分期为I～II期27例，III～IV期30例。对57例肾母细胞瘤患者进行随访，随访方式采取门诊复查、住院复查及电话随访相结合，随访时间为1～36月，其中52人获访，5人失访。

1.2材料取自新疆医科大学第一附属医院病理科均经术后病理证实的肾母细胞瘤57例癌组织及癌旁组织病理切片。常规10%中性甲醛固定、石蜡包埋。

1.3免疫组化染色染色方法按S-P试剂盒说明书步骤进行,乙醇脱蜡，水化，用高温柠檬酸修复抗原，过氧化氢室温孵育8 min，使过氧化物酶失活，加入第一抗体，分别为兔抗人Fosl-1单克隆抗体(1∶150)、兔抗人β-catenin单克隆抗体(1∶300)、兔抗人Wnt抗体(1∶200)4℃过夜,然后滴加二抗并37 ℃条件下孵育30 min。经DAB显色后, 苏木素复染, 中性树胶封片。阴性对照采用0.01 mol/L PBS (pH=7.4) 液体代替一抗, 其他步骤不变。S-P及DAB试剂盒均购自中杉金桥公司。

1.4结果判定标准[9-10]在正常情况下Fosl-1蛋白阳性染色定位于细胞核。β-catenin、Wnt蛋白阳性染色定位于细胞膜及细胞质,即连续的细胞膜染色。Fosl-1蛋白染色结果按照细胞染色强度判断：无染色0分(阴性)、浅黄色1分(弱阳性)、棕黄色2分(中度阳性)、棕褐色3分(强阳性)，1分为0%～10%，2分为11%～50%，3分为51%～80%，4分为81%～100%，评分<4分的标本定义为低表达，评分≥4分的标本定义为高表达[11]。β-catenin染色结果判断标准按王子伟等[12]的方法，分别从细胞膜、细胞质、细胞核3方面判断β-catenin及Wnt蛋白在细胞内的分布:细胞膜>70%细胞阳性为正常表达, 反之为表达缺失;细胞质或细胞核>10%细胞阳性为胞质或胞核阳性表达, 胞质或胞核表达为异位表达。异位表达和表达缺失统归为异常表达。

1.5统计学方法采用SPSS19.0软件进行统计学处理。计数资料以频数表示，计数资料组间比较采用(校正)卡方检验。计量资料用中位数表示，计量资料组间比较采用非参数检验。采用Kaplan-Meier方法绘制Fosl-1、β-catenin与Wnt蛋白阴性及阳性表达的生存曲线，应用多因素Cox比例风险模型研究预后的独立影响因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1肾母细胞瘤癌组织及癌旁组织中Fosl-1、β-catenin及Wnt蛋白的表达情况57例肾母细胞瘤癌组织中31例Fosl-1高表达，高表达率为54.4%(图1B)；57例癌旁组织中14例Fosl-1高表达，高表达率为24.6%(图1H)，其中10例已有病理等临床资料证实存在淋巴结或远处转移，癌转移率为71.4%；肾母细胞瘤癌组织中Fosl-1高表达率明显高于癌旁组织，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。癌组织中24例β-catenin异常表达，异常表达率为42.1%(图1D)；癌旁组织中13例β-catenin异常表达，异常表达率为22.8%(图1J)，其中9例已有病理等临床资料证实存在淋巴结或远处转移，癌转移率为69.2%；癌组织中β-catenin阳性(异常)表达率明显高于癌旁组织，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。癌组织中29例Wnt蛋白异常表达，异常表达率为50.9%(图1F)；癌旁组织中12例Wnt蛋白异常表达，异常表达率为21.1%(图1L)，其中有11例已有病理等临床资料证实存在淋巴结或远处转移，癌转移率为91.6%；肾母细胞瘤癌组织中Wnt蛋白异常表达率明显高于癌旁组织，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。提示Fosl-1、β-catenin、Wnt蛋白与肾母细胞瘤发生相关，且三种蛋白在癌旁组织中高表达或异常表达时肾母细胞转移率均较高。

2.2Fosl-1、β-catenin、Wnt蛋白三者在肾母细胞瘤癌组织及癌旁组织中的表达的关系采用卡方检验分析癌组织Fosl-1与β-catenin、Wnt蛋白表达的关系，癌组织中Fosl-1与β-catenin、Wnt蛋白的表达比较差异均有统计学意义(P<0.05)，即Fosl-1、β-catenin蛋白同时表达的癌组织与两者同时不表达的癌组织数相比差异有统计学意义，Fosl-1、Wnt蛋白同时表达的癌组织与两者同时不表达的癌组织数相比差异有统计学意义(表1)。癌组织中β-catenin、Wnt蛋白同时表达的癌旁组织与两者同时不表达的癌旁组织数相比差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。癌旁组织中Fosl-1与β-catenin、Wnt蛋白的表达比较差异均有统计学意义(P<0.05)，即癌旁组织中Fosl-1、β-catenin蛋白同时表达的癌旁组织与两者同时不表达的癌旁组织数相比差异有统计学意义，Fosl-1、Wnt蛋白同时表达的癌旁组织与两者同时不表达的癌旁组织数相比差异有统计学意义(表3)。癌旁组织中β-catenin、Wnt蛋白同时表达的癌旁组织与两者同时不表达的癌旁组织数相比差异有统计学意义(P<0.05)(表4)。

表1 癌组织Fosl-1与β-catenin、Wnt蛋白表达的关系/例

表2 癌组织β-catenin与Wnt蛋白表达的关系/例

表3癌旁组织Fosl-1与β-catenin、Wnt蛋白表达的关系/例

表4 癌旁组织β-catenin与Wnt蛋白表达的关系/例

2.3临床特征与Fosl-1、β-catenin及Wnt蛋白在癌组织及癌旁组织中的关系采用卡方检验分析性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期、转移情况与Fosl-1在癌组织、癌旁组织中的关系，在肿瘤大小、TNM分期及转移情况等临床特征下，Fosl-1在癌组织及癌旁组织中的表达有差异(P<0.05)，而在性别、年龄等临床特征下，Fosl-1在癌组织及癌旁组织中的表达无差异(P>0.05)，提示Fosl-1促进肾母细胞瘤发生及转移(表5)。

表5 不同临床特征与Fosl-1在癌组织、癌旁组织中表达的关系/例

采用卡方检验分析性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期、转移情况与β-catenin在癌组织、癌旁组织中的关系，结果显示在性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期、转移情况等临床特征下，β-catenin在癌组织中表达相关性均无差异(P>0.05)。在转移情况临床特征下，β-catenin在癌旁组织中的表达有差异(P<0.05)，而在性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期等临床特征下，β-catenin在癌旁组织中表达均无差异(P>0.05)，提示β-catenin可能参与肾母细胞瘤的转移(表6)。

表6 不同临床特征与β-catenin在癌组织、癌旁组织中表达的关系/例

采用卡方检验分别分析性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期、转移情况与Wnt蛋白在癌组织、癌旁组织中表达的关系，结果显示在TNM分期、转移情况等临床特征下，Wnt蛋白在癌组织、癌旁组织中表达均有差异(P<0.05)，而在性别、年龄、肿瘤大小等临床特征下，Wnt蛋白在癌组织、癌旁组织中表达相关性均无差异(P>0.05)，提示Wnt蛋白促进肾母细胞瘤发生及转移(表7)。

表7 不同临床特征与Wnt蛋白在癌组织、癌旁组织中表达的相关性分析/例

2.4影响肾母细胞瘤患儿总生存率的单因素、多因素分析分别将性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期、转移情况、Fosl-1、β-catenin与Wnt作为自变量，进行单因素Cox比例风险回归模型分析，结果显示转移情况、Fosl-1、β-catenin、Wnt蛋白可能对肾母细胞瘤患儿预后均有影响(P<0.05)。将转移情况、Fosl-1、β-catenin、Wnt蛋白表达情况作为自变量，进行多因素Cox比例风险回归模型分析，结果显示转移情况、β-catenin对肾母细胞瘤患儿预后有独立影响(P<0.05)，尚不能认为Fosl-1和Wnt对预后有独立影响(P>0.05)(表8)。

表8 预后因素Cox比例风险回归模型

2.5 肾母细胞瘤患儿Fosl-1、β-catenin和Wnt蛋白表达与预后的关系分别采用Kaplan-Meier法绘制Fosl-1蛋白低、高表达及β-catenin、Wnt蛋白正常及异常表达的生存曲线，Fosl-1蛋白低表达组的中位生存时间为67.23个月，Fosl-1蛋白高表达组的中位生存时间为32.66个月，两组生存情况差异有统计学意义(χ2=4.827，P=0.028，图2)。β-catenin表达正常组的中位生存时间为59.44个月，β-catenin表达异常组的中位生存时间为39.00个月，两组生存情况差异有统计学意义(χ2=6.458，P=0.011，图3)。Wnt蛋白表达正常组的中位生存时间为64.83个月，Wnt蛋白表达异常组的中位生存时间为38.06个月，两组生存情况差异有统计学意义(χ2=6.602，P=0.010，图4)。表明Fosl-1高表达、β-catenin及Wnt蛋白异常表达均降低肾母细胞瘤患儿生存率。

3 讨论

肾母细胞瘤通过手术、化疗、放疗等多种治疗手段的综合应用，总体生存率达85%，但是发生转移后其生存率明显降低。故寻找预测肾母细胞瘤发生转移及预后的特异性分子标志物对改善其预后尤为重要。

FOSL1主要通过位于115～168区域的bZIP结构域与Jun家族成员形成AP-1二聚体复合物，参与调控靶基因的转录作用[13]。另外，Fosl-1对细胞去稳定化具有重要作用。已有相关研究表明Fosl-1与脑胶质瘤的强侵袭性相关，Fosl-1可在Wnt/catenin信号通路激活下表达上调，诱导脑胶质瘤细胞发生EMT,增强细胞的侵袭性[14]。且有研究证明，大肠癌组织中，转录因子Fosl-1激活Smurf1的表达，Smurf1与抑癌因子FBXL2结合，促进FBXL2的泛素化和降解，从而激活β-catenin核异位，提高下游c-Myc、CCND1的表达，促进大肠癌细胞的生长和转移[15]。

Wnt信号通路是一个复杂的蛋白质库，β-catenin是Wnt信号通路中的关键分子，正常情况下β-catenin的胞浆浓度保持稳定，一旦β-catenin表达上调，经典Wnt通路将被激活，在肿瘤的发生发展及迁移中起着重要作用[16-17]。在Wnt信号缺失情况下，β-catenin 能被磷酸化后的多蛋白复合体降解。该多蛋白复合体失活情况下，β-catenin将大量在胞质内蓄积，达到一定浓度时进入细胞核内与 T 细胞因子(TCF)结合，激活TCF转录，进而导致下游靶基因进一步转录[18]。

本研究结果显示，肾母细胞瘤癌组织及癌旁组织中Fosl-1、β-catenin及Wnt蛋白表达组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，提示Fosl-1、β-catenin、Wnt蛋白与肾母细胞瘤发生相关。同时分析临床特征与Fosl-1、β-catenin及Wnt蛋白在癌组织及癌旁组织中的表达相关性，结果提示三者均与肿瘤转移相关(P<0.05)，运用多因素Cox比例风险回归模型分析，结果显示转移情况、β-catenin对肾母细胞瘤患儿预后有独立影响(P<0.05)，进而三者的表达影响肾母细胞瘤患儿的生存率。该研究结果与陆良生等[19]、陈永凤等[20]研究者的结果一致。

本研究只从组织学水平论证了相关蛋白表达情况，初步探讨了各蛋白在儿童肾母细胞瘤中的表达情况及三者之间的关系，但尚未明确信号通路及作用机制，仍需进一步研究，可进一步从分子生物学水平探讨及验证Fosl-1、β-catenin、Wnt在肾母细胞瘤发生及转移中的相互关系。