不同细胞源性外泌体在骨质疏松症中的研究进展

张锐柳海平赵宁李爱强柴喜平

甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050

外泌体(Exosomes)是由多种细胞分泌的一种细胞外囊泡(EVs)，直径为40～100 nm，与细胞具有相同的拓扑结构，内含丰富的蛋白质、脂质、核酸及糖缀合物，其包含一系列膜相关的高阶寡聚蛋白复合物，表现出明显的分子异质性，所具有的脂质双分子层结构能够轻松地与其他细胞的细胞膜融合，可以通过直接接触、内分泌或旁分泌的方式将其内含的生物活性物质选择性地传递进入靶细胞，实现细胞外基质的重塑及细胞间信号分子的传递。多项研究发现这种细胞间囊泡的运输方式在人类健康和疾病的许多方面发挥着重要作用，包括发育、免疫、组织动态平衡、癌症和退行性疾病[1-2]。近年来，多项研究发现不同细胞源性外泌体可以调节骨代谢，重建骨平衡，与骨质疏松症(osteoporosis，OP)有着密切的关系[3]。本文意在对不同细胞源性外泌体与骨质疏松之间的关系及其治疗OP的机制与可行性进行综述，以期为外泌体在OP的基础研究与临床诊疗中提供参考。

1 外泌体与骨稳态

骨骼是人体的主要支撑框架，具有刚性及自我修复能力，它为软器官提供保护，为负责造血和脂肪存储的骨髓提供了稳定的环境[4]。同时，骨组织是一种代谢高度活跃的组织，处于不断的生理活动中以去除旧的、受伤的骨，并新形成骨取代它，新形成的骨在促进或保持骨强度和适应不断变化的生物力学方面具有更强的机械性能，健康的骨骼总是处于这种动态平衡状态，随着年龄的增长，当骨吸收大于骨形成时，这种动态平衡失调时就会导致OP等严重疾病[5]。而这种动态平衡即骨稳态主要受成骨细胞(osteocblast，OB)、破骨细胞(osteoclast，OC)、骨髓间充质干细胞(BMSCs)、内皮细胞等多种细胞的调控。

OB是位于骨表面的大型立方体细胞，调控成骨，促进骨基质合成和随后的矿化；OC是一种来源于单核细胞/巨噬细胞谱系的大型多核细胞，能够在吸收区分泌Cl-、H+、基质金属蛋白酶(MMPs)和组织蛋白酶K(CtsK)来降解骨组织[6]；BMSCs是组织工程中最理想的种子细胞，在一定条件下可向成骨细胞定向分化，对于骨稳态的维持至关重要[7]；骨形成与骨微环境中的血管生成密切相关，而骨微环境中血管的生成需要多种内皮细胞与信号通路的参与[8]，因此内皮细胞参与了骨微环境稳态的维持。上述OB、OC、BMSCs及内皮细胞相互影响、相互调节，进而维持骨稳态，防治OP的发生。而细胞间信息相互交流的机制尚不清楚，传统理论认为细胞通过旁分泌途径分泌相关细胞因子而进行信息交流[9]。而外泌体是大多数细胞分泌的纳米级囊泡，它们被脂质双分子层包裹，并携带蛋白质、聚糖、脂质、DNA、RNA等生物分子，其被其他细胞吸收时，这些生物分子被转移并影响受体细胞的表型，从而发挥效应[10]。作为细胞间交流和遗传物质转运的重要介质，近年来多项研究发现OB、OC、BMSCs及内皮细胞等多种细胞分泌的外泌体在维持骨稳态、防治OP方面发挥了重要的作用。

2 不同细胞源性外泌体与骨质疏松

2.1 BMSCs源性外泌体与OP

BMSCs分化方向在骨代谢中扮演着重要的角色，外因及信号处理过程如何调控其分化方向是目前研究的热点，外泌体作为干细胞重要的旁分泌形式，可通过信号蛋白、RNA等物质调控BMSCs增殖和分化改善骨质疏松[11]。目前有多项研究报道，来源于BMSCs的外泌体(MSC-Exo)具有与BMSCs相似的功能，并且与BMSCs相比，MSC-Exo具有稳定性好、易保存、无免疫源性、易获得、转化方便等优点。因此具有上述特性的MSC-Exo可能是改善传统BMSCs治疗OP不足的理想替代品[12]。

研究发现，BMSCs来源的外泌体可通过多种信号通路来影响OP。丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是存在于哺乳动物中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞外刺激到细胞核的重要信号转导酶[13]。研究表明成骨细胞的基因表达和功能发挥与MAPK信号通路的刺激有关[14]，Zhao等[12]从大鼠骨髓中分离出MSC，提取MSCs衍生的外泌体(MSC-Exo)，而后将成骨细胞系的hFOB 1.19细胞作为研究对象，设立空白对照组、MSC-Exo干预组、MSC-Exo+JNK基因敲除组，结果显示，MSC-Exo干预组细胞存活率及细胞周期明显高于其他两组，因此得出结论，MSC-Exo可通过MAPK信号通路促进hFOB 1.19细胞增殖，从而延缓骨质疏松的发展。Wnt/β-catenin信号通路是调节骨代谢的重要分子途径[15]，Wnt信号的激活有助于成骨细胞介导的骨形成的骨量及强度的增加，因此，该通路对成骨细胞增殖及分化至关重要[16]。Zuo等[17]研究发现MSC-Exo可以减轻辐射诱导的大鼠骨丢失，机制可能与减轻氧化应激反应、加速DNA损伤修复、减少与抑制增殖和细胞衰老相关的蛋白以及通过激活Wnt/β-catenin通路恢复BMSCs成骨和成脂平衡相关。

核酸是外泌体的重要组成成分，包括mRNA、miRNA、lncRNA等[18]。其中miRNA是一类长17～24个核苷酸的非编码微小RNA[19]，包裹在外泌体中的miRNA能够被靶细胞摄取与靶mRNA 3’UTR结合，进而如同内源性的miRNA通过沉默靶基因而发挥其作用[20]。干细胞源性外泌体很大程度上是通过其携带的miRNA发挥成骨作用。Qiu等[21]研究发现BMSC来源的外泌体miR-150-3p能够促进OB增殖和分化，机制与上调Runx2、成骨细胞特异性转录因子(Osterix)、碱性磷酸酶(ALP)及骨钙素相关。Zhang等[22]发现MSC-Exo通过将miR-935传递到OB中抑制信号转导与转录激活因子1(STAT1)，而STAT1沉默则促进了OB和矿化结节中的ALP活性，从而抑制骨质疏松。Wang等[23]研究发现在MSCs成骨分化过程中，分化晚期细胞分泌的外泌体中miR-31、miR-144和miR-221低表达有助于诱导成骨分化，而分化晚期外泌体中miR-21显著增加，而miR-21可作用于成骨分化抑制因子Spry1和Sox2，另一方面miR-21可以通过调节PI3K-AKT-GSK3β通路，激活Runx2的表达而促进MSCs的成骨。lncRNA是长度大于200个核苷酸的长链非编码RNA，现已成为MSCs成骨过程中的新型调节剂。miR-34c可通过靶向SATB2和Runx2因子及抑制Notch通路中的多种因子影响成骨细胞与破骨细胞，从而在骨稳态中起关键作用[24]。MALAT1是最早鉴定出与人类疾病相关的lncRNA之一[25]，Yang等[26]研究发现MALAT1通过OPG/RANKL通路调节骨溶解，其下调可抑制破骨细胞活性。Yang等[27]研究发现miR-34c逆转了MALAT1的作用，SATB2逆转了miR-34c的作用，而BMSCs衍生的外泌体MALAT1通过介导miR-34c/SATB2轴增强了骨质疏松小鼠的成骨细胞活性，可减轻骨质疏松。

综上所述，骨髓间充质干细胞来源的外泌体不仅可以影响MAPK、Wnt/β-catenin等成骨相关信号通路，并且可通过其内含的miRNA、lncRNA等物质发挥调控BMSCs成骨分化的作用，从而减轻骨质疏松。

2.2 OB源性外泌体与OP

OB是骨微环境的重要组成细胞，可通过分泌外泌体参与调节成骨-破骨平衡。Ge等[28]对小鼠成骨细胞株MC3T3外泌体进行蛋白组学分析，发现1 069个蛋白质，进行功能富集分析发现，生物学过程主要集中在蛋白定位和细胞内信号通路，能够促进MSCs成骨分化的Integrin信号通路和在骨代谢平衡中发挥重要作用的mTOR信号通路备受关注；而分子功能显示在骨重塑中起重要作用的Rho GTP酶较为重要，这说明OB衍生的外泌体在成骨过程中发挥作用。研究[29]发现矿化前成骨细胞MC3T3-E1分泌的外泌体能够促进骨髓基质细胞(ST2)向成骨细胞分化，机制可能与MC3T3-E1分泌的外泌体改变了ST2细胞miRNA表达，这些改变的miRNA协同抑制Axin1，上调β-catenin蛋白，从而激活Wnt/b-catenin途径，刺激成骨分化。微环境由细胞外基质(ECM)和细胞分泌的外泌体及生长因子组成，Narayanan等[30]研究发现分化细胞的ECM调节干细胞的表型，而它们的外泌体包含控制干细胞分化表型的特异性指导因子(miRNA、RNA、蛋白质)，在带有OB外泌体的成骨细胞或成脂细胞外基质上分化的hMSCs都显示出成骨相关基因的表达，因此，在hMSCs谱系分化过程中，外泌体可能会覆盖ECM介导的指示信号。

另有研究发现，OB源性外泌体可能与破骨细胞形成相关。Deng等[31]研究表明OB源性外泌体含有RANKL蛋白，并且能够通过受体配体(RANKL-RANK)将其转移至破骨细胞前体，刺激RANKL-RANK信号传导，促进破骨细胞形成。研究[32]发现溶酶体膜蛋白-1阳性的成骨细胞外泌体携带了RANKL、骨保护素以及抗酒石酸酸性磷酸酶，从而促进破骨细胞形成。

因此，OB源性外泌体不仅可以加强成骨细胞的分化和矿化，并且含有控制干细胞表型的特异性指导因子，促使干细胞向成骨细胞分化，另一方面，OB源性外泌体与破骨细胞形成相关。而OB和OC之间这种外泌体介导的细胞间通讯可能代表了骨骼建模和重塑的新机制。

2.3 OC源性外泌体与OP

骨吸收由OC介导，OC是目前唯一明确有降解骨质功能的细胞，过度活跃的OC导致骨丢失和骨质疏松。因此在加强成骨作用的同时，如何调节OC的功能在防治OP方面十分重要。Li等[33]研究发现OC衍生的外泌体miR-214-3p可以充当细胞间信使以介导OC与OB的通讯，转移至OB以抑制骨形成，基于此，OC中miR-214-3p的治疗性抑制可能是逆转已确诊的OP的潜在骨合成代谢策略。Yang等[34]研究发现OC衍生的含有miR-23a-5P的外泌体可通过抑制Runx2和促进YAP1介导的MT1DP来抑制OB分化。成熟OC外泌体可抑制OB内Wnt/β-catenin信号通路，并诱导OB凋亡，促进OP的发展。Huynh等[35]报道了破骨细胞前体的外泌体有刺激破骨细胞成熟化的作用，然而通过对成熟破骨细胞的培养，却发现其分泌的外泌体抑制了破骨细胞生成。因此破骨细胞介导的外泌体的作用可能是双向的，其中的分子机制对OP的影响尚未明确，尚需进一步探究。

2.4 内皮细胞源性外泌体与OP

骨组织具有高度血管化的特点，骨内血管灌注不足与OP密切相关。新生血管不但能够运送氧气及重要营养物质，还可以加速细胞增殖及骨基质矿化[36]。研究[37]发现血管内皮组细胞衍生的含有miR-126的外泌体，可下调内皮细胞SPRED1基因表达，活化RAF/ERK1/2信号通路，促进血管内皮细胞增殖、迁移及血管生成。van Balkom等[38]研究发现内皮细胞释放的含有miR-214的外泌体通过作用于相邻内皮细胞，可抑制内皮细胞凋亡并促进其迁移，促进血管生成。

内皮细胞源性外泌体除了可以促进血管生成而在骨再生中发挥作用外，还可以抑制OC活性，治疗骨质疏松。Song等[39]研究发现内皮细胞源性外泌体比OB及BMSCs源性外泌体具有更有效的骨靶向性，内皮细胞衍生的外泌体可抑制OC的活性，在去卵巢小鼠OP模型中可抑制骨质疏松，对外泌体miRNA测序发现miR-155可能具有治疗OP的潜力。Yang等[40]研究发现血管内皮细胞衍生的外泌体可以通过抑制铁蛋白依赖性铁下垂治疗糖皮质激素诱导的骨质疏松症。但也有研究[41]发现老年骨质疏松患者内皮细胞源性外泌体含有miR-31，而miR-31作用于MSCs后成骨分化被抑制。因此内皮细胞源性外泌体对成骨和成血管的生理效应尚不清楚，仍有待研究。

3 总结与展望

OP是一种骨量减低和骨微结构破坏而易发生骨折的全身性骨骼疾病[42]。我国65岁以上人群OP患病率约为32%，由其导致的骨折发生率高达39%，预计2050年我国由OP引发的骨折人数将达599万，而相应医疗支出将高达1 745亿元，给家庭及社会造成了严重的经济负担[43]。研究发现其发病机制主要是骨形成与骨吸收呈负平衡，骨重建失衡造成骨丢失[44]。目前治疗骨质疏松症的药物可分为抗吸收调节剂和合成代谢药物，前者包括雌激素、雄激素受体调节剂、降钙素和双膦酸盐，后者有特立帕肽，但是这些药物通常会引起严重的不良反应。就特立帕肽而言，研究表明，77%服用20 μg的患者和78%服用40 μg的患者出现了关节痛、肌肉痉挛及疲劳等不良反应；长期使用雌激素会对大脑及子宫产生严重的不良反应；而长期降钙素治疗由于降钙素循环抗体的产生可导致机体耐受；目前最常用的治疗OP 的药物双膦酸盐会出现胃肠道刺激、骨骼和关节疼痛及下颌骨坏死等并发症[45]。因此，开发具有高骨靶向性和低毒性的药物势在必行。

外泌体是细胞间通讯的中心介质，通过将蛋白质、脂质及RNA传送至邻近或远处靶细胞，形成了一套全新的细胞间信息传递系统，通过影响细胞的生理病理状态与OP的发生及进程密切相关。MSC-Exo不仅可以影响MAPK、Wnt/β-catenin等成骨相关信号通路，并且可通过其内含的miRNA、lncRNA等物质发挥调控BMSCs成骨分化的作用，从而减轻骨质疏松；OB和OC源性外泌体介导的细胞间通讯可能代表了骨骼建模和重塑的新机制；而内皮细胞源性外泌体通过成骨与成血管生理效应可发挥防治OP的作用。因此不同细胞源性外泌体在OP的发生及进程中较为重要，研究其作用机制可为外泌体作为新的OP治疗策略奠定理论基础。

外泌体作为防治OP的新策略具有多种优势。与传统细胞疗法相比，外泌体具有较高的安全性[46]，其可避免细胞移植引起的栓子、肿瘤等并发症；与生物纳米材料相比，外泌体生物相容性较高而细胞毒性更低；并且外泌体因其穿过细胞膜及血脑屏障的能力及可调节的靶向效率，成为了递送药物及基因的理想载体[47]。但是将外泌体应用于骨质疏松的治疗还面临许多难题，例如，如何大量高效地分离提纯外泌体以及运输储存是一大难题；其次，如何使其准确定位到靶组织和靶细胞是临床应用面临的问题[48]。随着对外泌体研究的不断深入，将更系统更准确地了解其与靶细胞之间的信号机制，外泌体有望成为防治OP的具有良好前景的治疗策略。