机械敏感离子通道蛋白Piezo1响应机械力刺激调节骨代谢的研究进展

李晶 马铁 宋成林 李涛 高海宁 姚婷婷 晋俊杰 张超 胡广璇 刁小芮 衣雪洁 常波*

1.辽宁师范大学体育学院，辽宁 大连 116029 2.沈阳体育学院运动人体科学学院，辽宁 沈阳 110102 3.沈阳体育学院实验室管理中心，辽宁 沈阳 110102 4.沈阳体育学院研究生部，辽宁 沈阳 110102 5.沈阳体育学院运动与健康研究中心，辽宁 沈阳 110102

1 机械敏感离子通道概述

自然界中，凡是具有生命的个体在生长发育过程中时刻接受来自外界的机械刺激从而产生感知和响应。在哺乳动物中，骨的稳态感应会受机械力刺激传导[1]。机械敏感离子通道可以在毫秒级的时间内充当机械刺激的分子传感器，并在打开时将机械刺激转换为细胞内的电信号或化学信号[2]，该通道是完整成孔的膜蛋白[3]。可响应施加在细胞膜上的机械刺激，控制通道的封闭和开放达到允许离子和其他溶质流过细胞膜的目的[4]。

2 机械敏感阳离子通道蛋白Piezo1的生理特点

2010年，在小鼠神经母细胞瘤(mouse neuroblastoma，N2A)细胞系的研究中，发现由Fam38A所调控的蛋白质是一种离子通道，可以被压力激活产生稳定电流。研究者将其命名为 Piezo1，意义是“压力”，Piezo1为N2A中产生机械力(压力)激活电流所必需的，由Fam38B所编码蛋白质Piezo2，是响应于背根神经节(dorsalroot ganglion，DRG)神经元的机械刺激所必需的，二者共同组成了目前的Piezo离子通道家族。Piezo通道是对阳离子具有非选择渗透性的大型跨膜蛋白，对Na+、K+、Ca2+、Mg2+全部渗透，但更偏向Ca2+[5-6]。Piezo1蛋白的结构在冷冻电镜下是一种类似三叶螺旋桨的三聚体，包括一个中央离子传导孔模块和3个高度弯曲的非平面结构叶片[7]。每个叶片有9个重复的结构单元，每个单元有4个跨膜螺旋，这些螺旋单元通过梁状结构连接到孔中，叶片梁结构可能形成杠杆状的分子内转导通路，用于中心孔的长距离机械门控[8-10]。Piezo1在神经细胞[11]、软骨细胞[12]等多种细胞[13-15]中表达。Piezo1的机械敏感性不需要借助其他蛋白质或第二信使信号激活[16]，对细胞感受力学方面的压力和机械力门控非选择性阳离子电流的产生至关重要。

3 机械力通过Piezo1对骨代谢的影响

代谢性骨病一般是由于先天或后天原因使机体正常骨代谢过程和生理状态紊乱，导致骨生化代谢发生障碍，其中以骨质疏松最为常见。骨质疏松主要以骨量减少、骨微结构破坏、骨强度下降为主要特征，且骨质疏松症患者极易发生骨折。正常成人的骨骼中破骨细胞与成骨细胞处于一种动态平衡，使骨组织不断更新以维持骨骼的强度和弹性；骨的动态平衡被破坏后会导致骨的丢失引起骨质疏松[17-18]。骨作为承重器官，不断受到来自身体内部(肌肉)和外界(地球重力)力的影响[19]，该影响可增加骨骼强度[20-21]。缺乏机械力，如长期卧床和微重力环境下会减少骨量[22-23]。而Piezo1可以在生物体内响应机械力[24]，研究发现，Piezo的基因变化与机械力反应、人类骨密度和骨折有关[25]，且Piezo1水平的降低与骨质流失的增加关系密切[17]。所以Piezo1在骨组织中应答机械力的潜在作用机制可以为改善骨代谢疾病提供参考。

3.1 机械力通过Piezo1影响间充质干细胞分化的潜在机制

成骨细胞和骨髓脂肪细胞起源于骨髓来源的间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs)。而成骨与成脂过程“此消彼长”[26]。在骨质疏松患者体内，BMSCs 向脂肪细胞分化能力增强，导致成骨分化和成脂分化的不平衡，骨折的风险加大[27]。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)对机械应力的刺激十分敏感。细胞外信号调节激酶 1/2 (extracellular regulated protein kinases l/2，ERK1/2)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases，p38 MAPK)通路可响应施加在脂肪干细胞 (adipose-derived stem cells，ADSCs)上的机械拉伸并将它转导为细胞内成骨信号[28]。

研究发现，Piezo1在MSCs中介导成骨细胞分化[29]。Piezo1在MSCs中作为静水压(hydrostatic pressure，HP)刺激的感受体来激活ERK1/2和p38 MAPK信号通路诱导骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein 2，BMP2)表达，增加成骨细胞分化、减少成脂细胞分化。BMP2是成骨细胞从MSCs分化的重要生长因子[30]，而阻断BMP2功能可抑制HP诱导的成骨标记基因表达。使用 Yoda1(Piezo1特异性激活剂)刺激MSCs时成脂分化减弱，成骨细胞分化增强。MEK和p38 MAPK抑制剂会抑制HP和Yoda1诱导的BMP2表达。机械力的信号转导需要ERK1/2信号通路的激活[31]，所以ERK1/2和p38 MAPK可能在HP-Piezo1-BMP2表达中起信号分子的作用。在大鼠牙髓细胞中，ERK1/2 在低强度脉冲超声处理后24 h被激活，但钌红(离子通道阻滞剂)可以抑制ERK1/2的激活[32]。人类牙髓来源的MSCs(human dental pulp stem cells，HDP-MSCs)经过短时间的Yoda1刺激使细胞内Ca2+浓度增加，但是Yoda1诱导的Ca2+反应被Piezo1通道抑制剂以及Piezo1特异的siRNA抑制[33]。该研究认为，Piezo1通道被激活可以诱导ATP释放、P2受体嘌呤信号传导，以及下游信号通路PYK2和MEK/ERK的传导来促进MSC迁移，为调节MSC迁移的分子和信号机制提供新的见解。巧合的是，Piezo1在MC3T3-E1成骨细胞的迁移过程中作用巨大，敲除该细胞中Piezo1基因将影响其迁移能力[34]。

3.2 机械力通过Piezo1调节成骨细胞、破骨细胞平衡的潜在机制

骨的发生和生长包含成骨和破骨同时进行，成骨细胞不断分化成熟形成新骨质，破骨细胞分泌酸性物质和蛋白酶来吸收旧骨质，使骨化中心向四周扩展，骨质不断重建，骨组织体积增加[35-36]。二者的变化使净骨量发生动态变化，所以平衡成骨-破骨过程至关重要。有趣的是，多个研究发现，机械载荷刺激成骨细胞系导致机械敏感阳离子Piezo1表达产生差异[37-39]。

3.2.1机械力通过Piezo1刺激YAP1和TAZ控制成骨细胞Wnt1表达：Hippo信号途径的激酶链内的转录共激活因子 YAP(yes-associated protein，YAP)和类似物 TAZ(transcriptional co-activator with PDZ binding motif，TAZ)在成熟的成骨细胞及骨细胞中可以通过促进骨形成并抑制骨吸收的方式调节骨稳态[40]。在小鼠的成骨分化过程中YAP1/TAZ表达增加，且骨形成相关因子Runt相关转录因子2(runt related transcription factor 2，Runx-2)、骨钙素、骨桥蛋白等表达也相应增加[41]，而Piezo1能够调节YAP的核定位[42]。

成骨细胞中Piezo1敲除的小鼠在出生3 d后即出现多处骨折，并且表现出严重的骨质疏松、骨量明显减少等变化。尾部悬吊导致对照小鼠远端股骨骨量丢失，Piezo1基因敲除小鼠则没有该表现；该处理增加了对照小鼠的抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)表达，Piezo1基因敲除小鼠同样没有该表现，这显示Piezo1基因敲除的小鼠对后肢卸载导致的骨丢失有一定抵抗力。该实验中对Piezo1敲除和对照小鼠的BMSCs衍生的成骨细胞进行机械压缩干预后，发现Piezo1通过YAP促进Ⅱ型胶原酶(collagenase Ⅱ，COL2)和Ⅸ型胶原酶(collagenase Ⅸ，COL9)的表达，这些胶原酶抑制破骨细胞活性，所以机械力刺激Piezo1后通过YAP调控成骨细胞和破骨细胞的动态平衡[43]。在培养的骨细胞中由流体剪切应力诱导的Piezo1基因表达增加，而 Yoda1对Piezo1的刺激可以模拟流体剪切应力对骨细胞的影响。向成年小鼠给药Yozo1增加了骨量，模拟了机械负荷的影响。该实验还进一步证明了在骨组织中Piezo1通过YAP1/TAZ控制Wnt1表达，流体剪切应力通过刺激Piezo1来影响Wnt1和rankl表达，控制成骨或者破骨通路[21]。Wnt1通过增加细胞核内的β-连环蛋白(Beta catenin，β-catenin)来提高骨形成相关因子Runx2的水平，增加成骨细胞的分化[44-45]。所以，在小鼠体内，机械刺激通过Piezo1控制成骨细胞、破骨细胞的平衡来调节骨量。

3.2.2机械力通过Piezo1控制成骨细胞中CaMKⅡ/Creb表达：骨骼细胞(骨吸收和骨形成)的协调功能维持钙化组织(即骨)的稳态，钙化组织既储存钙又控制细胞外Ca2+的浓度[46]。Ca2+在骨骼细胞的调节中充当关键的细胞内第二信使[47]，Ca2+的涌入可能导致CaMKⅡ(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMK Ⅱ)磷酸化并激活环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein，Creb)途径，从而促进成骨细胞分化[48-49]。

在成骨细胞中敲除Piezo1的小鼠成年后发育迟缓，出现严重的骨发育缺陷。后肢悬吊的实验中，对比未干预小鼠悬吊小鼠的小梁骨矿物质密度等指标均明显降低，而Piezo1敲除小鼠则没有上述表现。同样证明了Piezo1敲除小鼠对机械卸载导致的骨质量和结构相关参数变化具有一定抵抗力。并且将正常的骨细胞放在低重力模拟器中(模仿太空飞行)或使小鼠处于模仿卧床休息的条件下Piezo1表达下调。机械负荷刺激使对照小鼠Piezo1的mRNA和蛋白质水平显著增加，并伴随着成骨细胞功能标记基因表达的增加，而敲除小鼠没有该变化。利用流体剪切力刺激成骨细胞也得到了在体实验机械干预相似的结果[19]。Piezo1还可以使成骨细胞CaMKⅡ/Creb信号通路激活，导致成骨细胞分化增加，而Piezo1敲除小鼠成骨细胞中CaMKⅡ和Creb的磷酸化水平降低，且伴随着Runx2和激活转录因子4(activating transcription factor-4，ATF4)的蛋白表达表达降低，成骨分化受损[19]。这表明Piezo1是感受力刺激的响应靶点，在Piezo1缺失后不会对力刺激做出相应的反应；且会通过CaMKⅡ/Creb信号通路影响成骨分化。

3.2.3机械力通过Piezo1控制成骨细胞AKT表达：丝氨酸/苏氨酸激酶 AKT信号传导在多种细胞代谢、细胞存活、细胞增殖、细胞生长和分化途径中具有关键作用[50]。骨细胞中硬化蛋白(Sclerostin，Sost)减少使Wnt/β-catenin 信号通路得到激活，促进骨形成[51]，且Sost可以参与机械刺激的成骨作用[52]，尾部悬吊小鼠血清中的Sost水平增加，而机械负荷抑制了该表达[53]。

Piezo1激动剂Yoda1增加了细胞内钙动员，并剂量依赖性地降低了鼠类骨细胞系IDG-SW3中Sost的表达。对IDG-SW3细胞进行机械拉伸抑制了Sost的表达，这一结果被GsMTx4干预以及Piezo1基因沉默所逆转。此外，通过用Akt抑制剂治疗消除了机械拉伸对Sost表达的抑制[54]。这表示Piezo1可能通过AKT调节Sost的表达。另一项研究中，在成骨细胞系MC3T3-E1细胞中Piezo1受到流体切应力的刺激表达升高，诱导成骨细胞关键基因Runx-2的表达。然而，使用小干扰RNA沉默Piezo1后则不会出现上述结果，且机械力刺激AKT/GSK-3β/β-catenin信号转导通路的效果被抑制[55]。这表示在MC3T3-E1细胞系中，Piezo1作为感受器感受外部机械力(流体剪切应力)的刺激，诱导AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路的激活，促进成骨细胞Runx-2基因表达。

3.3 机械力通过Piezo1调节软骨细胞活性的潜在机制

关节软骨是密集的结缔组织，排列在关节表面上，为关节承受负荷提供降低摩擦[56]。软骨细胞作为关节软骨中存在的唯一细胞单元，承载来自内部(牵张力、剪切力)和外部(机械应力)力的刺激，而软骨受到破坏使软骨细胞发生凋亡，或者受到炎症影响产生相关的增生，则会造成膝骨性关节炎的发生。

将Piezo1特异的siRNA转染到培养的原代软骨细胞中以沉默Piezo1表达。然后，使用循环拉伸应变(cyclic tensile strain，CTS)施加至沉默和对照处理的细胞8 h。在Ca2+成像系统中检查到拉伸刺激诱发的软骨细胞中Ca2+的特性取决于拉伸强度，转染siRNA使Piezo1基因沉默后的细胞拉伸诱发的Ca2+变化得到了显著抑制，这表明拉伸刺激后软骨细胞的Ca2+信号转导需要依赖于Piezo1[57]。但是也有研究认为，Piezo1离子通道导致的钙离子过载导致软骨细胞凋亡[58]。小鼠成骨细胞敲除Piezo1导致出生后早期骨密度降低、自发性骨折发生率增加且影响次生海绵体，体内尺骨加载实验证实了骨细胞机械感觉需要 Piezo1。在软骨细胞中Piezo1基因缺失的小鼠和上述成骨细胞中删除Piezo1小鼠的表型相似。对原代成骨细胞培养后，转录组分析发现成骨细胞删除Piezo1的小鼠软骨细胞相关基因，如SRY相关高迁移率组基因9(SRY-related high mobility group-box gene 9，Sox9)和周期蛋白依赖激酶抑制因子1C(cyclin dependent kinase inhibitor 1C，Cdkn1c)发生变化。ATDC5软骨细胞给予Yoda1刺激后可以观察到Piezo1表达增加明显，且流体力刺激显著增加MC3T3-E1细胞Piezo1表达[59]。这些数据表明 Piezo1通过调节软骨细胞相关因子表达影响软骨内骨化过程，这可能是Piezo1在治疗骨代谢疾病的又一重要方向。

4 总结和展望

机械负荷可以增加骨量、上调骨密度。机械敏感阳离子通道蛋白Piezo1是连接外界机械负荷刺激与哺乳动物体内生物信号的重要因子，可以作为骨感受机械刺激的传感器，在骨代谢和骨骼重建方面发挥作用，为研究者继续了解机械负荷刺激调控骨代谢和骨重建提出了新的思路，也为未来深入研究机械力刺激通过Piezo1改善骨科疾病提供了新的发展空间。