微生物快速检测技术研究进展

◎ 韩金龙，闵武琼，叶富饶，王 琴，董 梅，赵 璐

（1.渭南市检验检测研究院，陕西 渭南 714000；2.渭南初级中学，陕西 渭南 714000；3.渭南市市场监督管理局，陕西 渭南 714000）

食品质量和安全控制需要在食品加工关键点进行实时监控，快速准确的分析方法是保证产品质量符合标准和安全的先决条件。在食品和饲料生产加工过程中，快速检测腐败细菌、病原体和其他微生物污染物对降低腐败事件的发生概率和确保安全的食品供应至关重要。微生物生长是食物腐败最常见的原因，可能表现为肉眼可见的菌落生长，组织质地变化或产生异味。食品的微生物腐败是一个重要的经济损失和浪费问题，全球预计有33%的粮食损失源于微生物腐败。微生物污染的快速检测和识别有助于制定有针对性的控制措施，以遏制微生物通过食品加工地区的传播。世界范围内每年约有6亿人因食用微生物污染食品而患病，42万人因此死亡，微生物污染一度成为全球最重要的食品安全问题。近年来，微生物快速检测方法的研究进展受到广泛关注。根据主要原理，这些快速检测方法可分为基于微生物核酸的检测、基于免疫学方法和基于生物传感器的方法3类。

1 核酸检测方法

微生物的核酸具有高度的种间特异性，以微生物核酸为靶点检测食品病原体的最大优势是高特异性，通过将待检微生物中的核酸序列与一个合成的互补核苷酸序列杂交来检测，根据其使用的方法可以分为以下4种方法。

1.1 PCR

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是目前最常用、最成熟的检测微生物的核酸扩增技术。对于特定的物种，对引物扩增出的核酸序列进行测序比对，很容易实现病原微生物的特异性检测。相比于传统的生化鉴定法，PCR法优势在于高特异性、快速、灵敏，基于此原理开发的食品病原体检测方法已得到广泛的开发利用[1]。PCR也可用于毒素检测，主要是通过扩增编码细菌毒素的特定基因实现检测。

1.2 多重PCR

同时扩增多个位点从而在一个反应中快速检测多个微生物，被称为多重PCR（mPCR）检测方法。而引物设计是mPCR的关键难题，多个引物之间可能存在相互作用，因此可能需要调整引物浓度、PCR条件等因素，以产生足够的用于分析的核酸序列。如今，mPCR还可以用来定义某些微生物群落的结构，并评估群落动态，如发酵过程中或对环境变化的响应。

1.3 定量PCR

定量PCR（qPCR）是一种能够在整个反应过程中连续监测PCR产物形成的方法。它提供了目标基因的快速、同步扩增和序列特异性检测，并越来越多地应用于微生物检测[2]。使用该方法可以定量食品中的特定微生物，并通过研究合适的目标基因的表达，研究其在环境（食品成分、温度、pH值和O2等）影响下的行为。同时，该过程的实时监测意味着无需对样品进行凝胶电泳等扩增后处理，减少了分析时间。

1.4 恒温扩增技术

虽然PCR法已广泛应用于各种微生物基因组检测，但其需要多个热循环来分离扩增双链DNA。在过去的20年里，许多新的方法已经发展到在等温条件下扩增核酸包括环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）、依赖核酸序列的扩增技术（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification，NASBA）、滚环扩增（Rolling Circle Amplification，RCA）和链置换扩增术（Strand Displacement Amplification，SDA）。恒温扩增的硬件要求比PCR低，不需要热循环系统，甚至可以使用简单的水浴装置进行扩增。

LAMP是一种高效、低成本、简便、高灵敏度和高特异性的检测方法，广泛应用于微生物检测领域。该方法依赖于Bst DNA聚合酶大片段自动循环链置换DNA合成，与PCR不同的是，该方法主要设计4～6条引物针对靶基因的6～8个特定区域。LAMP反应通常在60 min内产生10倍或更高水平的茎环DNA扩增产物。用SYBR Green I染料代替常规凝胶电泳分析，可以用肉眼观察LAMP产物；存在LAMP扩增序列时，溶液颜色变为绿色，不存在LAMP扩增序列时，溶液颜色仍为橙色。

NASBA是一种检测RNA或DNA的等温扩增反应。该反应通常由3种酶组成，包括T7 RNA聚合酶、RNase H和禽骨髓母细胞瘤病毒逆转录酶，以单链RNA为模板扩增序列。NASBA能够特异性地针对目标RNA或DNA序列，并因其广泛应用于临床、环境和食品样本的病原体检测而日益流行。

2 免疫学方法

基于抗原-抗体结合的免疫检测被广泛应用于食源性病原体的检测，这些测定主要依靠抗体与抗原的特异性结合。各种抗体已被用于不同的试验类型，以检测食源性病原体和微生物毒素。

2.1 酶联免疫吸附分析

酶联免疫吸附（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种应用最广泛的检测食源性病原体的免疫方法，也是一种非常准确和敏感的检测抗原或半抗原的方法[3]。传统的ELISA反应通过显色剂和底物反应，产生某种可观察到的颜色变化，以光吸收波长变化为检测指标。

2.2 侧流免疫层析

虽然ELISA已广泛应用于许多实验室，但该方法仍然需要各种设备和训练有素的检测人员。越来越多的基于横向流动免疫分析的现场免疫技术，如试纸法、免疫层析法和免疫过滤法等在食品工业和医药中的病原体、霉菌毒素和疾病检测领域得到了越来越多的关注。在侧流免疫层析中，样品溶解液通过毛细管作用沿固体层析介质流动。样品的不同组分通过层析后与着色试剂结合（胶体乳胶或金颗粒标记的抗体或抗原），遇到用抗体或抗原预处理过的层析界面区域，样品中的分析物特异性结合会展示出不同的颜色。大多数侧流免疫层析在样品层析后的2～10 min内会出现可视化显色反应。作为一种定性检测方法，可以实现病原微生物的快速便携检测。

2.3 免疫磁珠分离分析

免疫磁珠分离（Immunomagnetic Separation，IMS）是利用免疫磁珠作为捕获试剂，针对性地捕捉病原微生物的方法。IMS原理类似于传统的微生物选择性筛选富集，即特异地捕获检测病原体，使病原体达到检测浓度。分析过程主要包括2个基本步骤。①将目标微生物样品与免疫磁颗粒混合孵育1 h，然后利用磁选机进行分离。②对结合免疫磁珠的微生物复合物进行多次洗涤，去除污染物。

3 生物传感器检测

生物传感器包含生物材料、生物衍生材料或仿生学材料，可以是光学材料、电化学材料、温敏材料和压电材料等。用于病原微生物检测的生物传感器设备通常可以分为3部分，包括生物捕获分子、将生物捕获分子-靶标相互作用转换为信号的方法以及数据输出系统。生物传感器最大的优点是能够快速或实时检测、便携和实现多病原微生物检测，可用于生产现场和生物实验室分析。据报道，生物传感器已被开发并应用于食源性病原体的微生物分析，包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌以及各种微生物毒素[4]。

3.1 光学生物传感器

光学生物传感器是传统分析技术的替代品，具有高特异性和高灵敏度的优势。生物传感器检测通常依赖于酶系统，该系统通过催化将分析物转化为一定产物，可在工作电极上氧化或还原，并保持在特定的电位。光学生物传感器技术可以根据吸收、反射、拉曼、红外、化学发光、色散、荧光和磷光等原理分为几个亚类。在过去的10年中，各种用于快速检测食品工业中的病原体、毒素和污染物的光学生物传感器被开发出来。该技术的主要优点是实时检测，而且所需仪器成本较低。

3.2 压电生物传感器

压电生物传感器能够根据沉积质量与其频率响应之间的线性关系，对微量的分析物进行敏感检测，是一种有效的替代无标记光学传感器，如表面等离子体共振光谱和干涉测量。压电生物传感器已得到广泛应用，对致病菌释放的特定挥发性有机化合物的嗅觉感应是确定食品污染的较为突出的方法之一。

3.3 免疫传感器

基于特异性抗体-抗原相互作用的免疫传感器是通过将反应物固定在传感器的表面，检测抗原与抗体相结合，将表面变化参数转换为可检测的电信号。由于抗原对固定化抗体的扩散限制，实时测量免疫反应较为困难，特别是对于低水平的污染物。然而，大多数免疫传感器在20～90 min内产生结果，与传统技术和经典的ELISA相比，免疫传感器接近实时反应。

3.4 电化学生物传感器

基于电化学的检测方法是进一步基于转导的系统，已被用于识别和定量微生物。根据观察到的电流、电位、阻抗和电导等参数，电化学生物传感器可分为安培响应、电位响应、阻抗响应和电导响应。为分析食源性病原体而开发的电化学生物传感器主要使用电化学阻抗谱作为转导技术，从而为细菌检测提供了无需标签、在线、高通量的设备。阻抗谱是研究导电材料及其界面的一种有效方法，通过这种技术，将一个小幅度和可变频率的循环函数施加到换能器上，并利用产生的电流计算出每个探测频率处的阻抗。阻抗生物传感器是基于测量细菌细胞附着或与电极相关联时电特性的变化检测食源性病原体[5]。

4 结语

近年来，人们已经探索和发展了几种快速检测食源性病原体的方法。然而，大多数检测方法仍然需要提高灵敏度、选择性或准确性，才能有实际用途。检测基质会对微生物的检测产生重大影响，因此需要对检测原材料基质中微生物的分离技术以及在免疫、核酸或生物传感器检测之前的样品浓度进行更多的研究。尽管在过去的几十年对食源性病原体的检测进行了大量的研究，但目前的技术仍有改进的空间，最终目标是实现微生物高效、精准、便捷的检测。