黑木耳液体菌种的制备工艺及质量标准

冯伟林 金群力 叶晓菊 吕明亮 蔡为明*

（1. 浙江省农业科学院园艺研究所，浙江 杭州 310021；2. 龙泉市食药用菌产业办公室，浙江 龙泉 323700；3. 丽水市农林科学院，浙江 丽水 323050）

菌种是食用菌生产的基础，而液体菌种较传统菌种生产效率、接种效率高，是代料食用菌生产实现从传统生产向专业化、集约化生产升级发展的关键技术之一[1]。液体菌种目前仅限于工厂化瓶栽金针菇、杏鲍菇、海鲜菇等少数几种食用菌生产应用。袋栽食用菌尤其是黑木耳的高效液体菌种生产与应用工艺技术的研究报道较少。

通过对黑木耳液体菌种制备的适宜菌株[2]、配方、发酵条件等开展技术集成试验，提出安全高效的黑木耳液体菌种制备工艺及质量评价标准[3,4]。

1 液体专用母种的制作

采用PDA综合培养基制作母种培养基，配方：土豆200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、KH2PO41.5～2 g、MgSO40.5～1 g、水1 000 mL。可根据需要采用营养加富培养基，即在上述配方基础上，加入20 g麸皮或0.5 g蛋白胨。配制好的培养基用漏斗分装至试管，试管口壁不粘培养基，塞棉塞，包牛皮纸。每7支或10支捆成一捆，管口用牛皮纸包好，直立于灭菌锅内，121～126 ℃、0.11～0.15 MPa下灭菌30 min，待培养基冷却至60～70 ℃，将其摆成斜面，冷却备用。

当培养基温度降至30 ℃以下时，于无菌室内接种，品种选用‘黑山’，将菌种用接种钩接入空白培养基，动作迅速、准确。切取菌种时选远离原老菌种的部位，一般培养基两端的活力最强，菌种块大小为1～2 mm，块越小菌龄越一致。（26±1）℃避光培养，10天左右菌丝即可长好，菌丝生长健壮、洁白、均匀一致、无杂菌污染的，为优良菌种。

2 摇瓶种制作

选用经试验优化的配方：葡萄糖3%、蛋白胨0.3%、KH2PO40.05%、MgSO4·7H2O 0.05%、维生素B10.05%，制备培养基。培养液装入三角瓶后塞棉塞，外包一层大小合适的纱布，再加盖一层牛皮纸，用线绳绑好，放入灭菌锅内。0.10～0.12 MPa，恒压灭菌35～40 min。待培养基冷却后，于消毒过的超净工作台内，每瓶接种2～3 mm见方的母种块7～8块，迅速转接并封口。于25～27 ℃恒温箱中静置培养1天后，置于磁力搅拌器或恒温摇床上培养6～8天，控制温度在25～27 ℃，转速140～160 r/min。

3 发酵罐液体菌种生产

液体菌种生产对环境要求严格，生产地点应远离粉尘污染严重的加工厂、公路、闹市等区域，远离产生有害气体的化工厂和养殖场。发酵罐初次使用、长期放置、更换品种或出现杂菌等情况时，应采取煮罐和空消。蒸气压力0.15 MPa、温度126 ℃，维持40 min。

3.1 培养基配制

选用经试验优化的配方：玉米粉8.4 kg、黄豆粉8 kg、红糖5 kg、蛋白胨1.2 kg、硫酸镁270 g、磷酸二氢钾540 g、水600 L；按照需要加入一定量的消泡剂。

原料加水搅拌均匀，不能有结块，用吸管或漏斗通过上料口将原料加入罐体，装液量为罐体容量的70%～80%，通入空气搅拌1～2 min，混合均匀，拧紧上料口盖。

3.2 灭菌

发酵罐加热层通入冷水，水位低于排水口20 cm，关闭进、排水阀门加热。待加热层压力达到0.05 MPa 时缓慢打开排气阀降压至0 MPa，关闭排气阀，再次升压至0.11 MPa；待发酵罐培养层压力达到0.05 MPa时缓慢打开排气阀降压至0 MPa，关闭排气阀，再次升压至0.11 MPa，同时打开空气过滤器灭菌，微开排气阀，维持40～50 min。

3.3 冷却

灭菌结束，关闭空气过滤器灭菌阀与排气阀，缓慢打开空气过滤器排水阀，降压至0 MPa，加热层通入冷水降温；同时缓慢打开发酵罐培养层排气阀降压，待压力接近0 MPa时向培养层内通入无菌空气，调整排气阀，维持罐压0.04～0.05 MPa，培养液温度降至25 ℃以下时，关闭加热层进水阀。

3.4 接种

将发酵罐接种口用75%酒精消毒，轻微打开呼吸器阀门，使发酵罐压力为0.01 MPa。点燃火焰圈，在火焰保护下用镊子去掉接种管上的牛皮纸和棉塞，打开接种口阀门，将接种管插入接种口，将摇瓶菌种注入发酵罐。拔出接种管，关闭接种阀门，去掉火焰圈，打开空气压缩机。

3.5 发酵罐菌种培养

根据菌丝生长情况，适时调节进气阀，通入适量无菌空气，同时调节排气阀，维持罐压0.04～0.05 MPa，温度控制在（26±1）℃，培养6～8天。

3.6 接种量

栽培袋折径为15.8×37.8（cm）的料包，每包接菌种25～30 mL，800 L发酵罐，每罐可供接2万包以上。

4 黑木耳菌种质量检测与分析评价

4.1 液体菌种质量标准

色泽方面，菌丝球或菌丝片段呈白色，菌液呈浅黄色至浅棕色、透明。形态方面，菌液稍粘稠，有大量菌丝球或菌丝片段悬浮，分布均匀，不迅速分层，菌液不浑浊。排气口气味正常，有黑木耳液体培养时特有的香气，无酸、臭等异味。显微镜下可见黑木耳菌种液体培养中特有的菌丝形态，球状和丛状菌丝体大量分布，菌丝粗壮，无杂菌。pH 4.5～5.5，菌丝湿重0.1～0.2 g/mL。

4.2 菌株活性保持检测

取待用菌液、pH 8.4的Tris-HCl缓冲液和TTC溶液各400 μL至离心管中，于37 ℃反应3 h。反应完成后立即将样品置于冰上，4 ℃离心再水洗2次，在离心后的细胞沉淀中加入1 mL无水乙醇萃取剂，室温下从细胞中提取TF。12 000 r/min离心5 min后，取上清液0.7 mL在紫外分光光度计上测定485 nm处的吸光度，每处理3次重复。可用作退化菌株与正常菌株的鉴别指标。

5 优势与存在问题

由于生产设备投资大，对技术要求高，液体菌种更适合于工厂化大规模生产，不仅缩短生产周期，而且可降低成本。生产中使用液体菌种相比使用固体菌种，具有以下优势：一是菌丝满袋快，由于固体菌种接种只在培养料的表面萌发，而液体菌种则从上到下一起萌发，菌丝满袋速度明显更快；从接种到菌丝长满，液体菌种需25～30天，而固体菌种则需要45～55天。二是菌种生产成本低。三是菌种生产周期短。四是栽培袋内菌丝菌龄更为一致，耳更整齐，解决了固体菌种规模化生产中菌种生长同步性差的问题。

虽然生产中应用液体菌种有诸多优势，但浙江地区以秋耳及春耳为主，液体菌种接种的菌包，培养期往往处于高温高湿的环境中，菌包极易受到污染而报废。又由于菌包生产时间集中，液体菌种发酵、接种设备投资大而利用率较低，导致制包公司对其投资不积极，制约了产业发展升级。