糖原合成酶激酶3β(GSK3β)参与调控视网膜疾病的研究进展△

刘晓晖 徐 静 吴 京

目前，全世界有数百万患有各类视网膜疾病患者，如糖尿病视网膜病变(DR)、老年性黄斑变性(SMD)等。视网膜作为眼球最内部的感光结构，是中枢神经系统的一部分。视网膜结构特征和功能的多样性决定了其易受内外环境的影响，其调节自身状态的机制也更为复杂。糖原合成酶激酶3β(GSK3β)是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶，存在于几乎所有的真核生物中。越来越多的证据表明，GSK3β是影响视网膜疾病进展的重要分子，并且GSK3β作为综合多条信号通路的中心点，参与调节细胞功能障碍的多种病理事件[1-2]。然而，不同研究者之间的实验结果存在一定的矛盾性，这表明GSK3β调控视网膜疾病的复杂性[3-4]。为此，本研究回顾并整理了GSK3β在不同视网膜疾病中的调节作用的相关研究，并进行综述。

1 GSK3β的生物学特性

GSK3β是糖原合成酶激酶3的两种经典亚型之一，它在结构上高度保守。最初的研究表明GSK3β是调节糖原代谢的关键酶，近来研究发现其可以参与许多其他细胞活动的调节，广泛地影响多种生物功能。GSK3β在静息细胞中的活性很高，其活性受到许多因素的影响。研究证实，GSK3β含有负调节的N端结构域和C端结构域以及包括ATP结合位点和酶活性位点的激酶结构域。GSK3β可以整合各种上游通路的信号刺激并通过多种调节方式调控自身的活性从而影响下游通路特异性底物来发挥不同的功能。磷酸化作为常见的翻译后修饰之一，是GSK3β活性最重要的调节方法，主要依赖于GSK3β N端Ser9的快速和可逆的磷酸化，磷酸化的Ser9与位于启动磷酸盐结合位点内的3个高度保守的基本残基相互作用，继而阻断底物结合和失活催化底物结构域。除了翻译后修饰，其他形式的调节如GSK3β-β-catenin蛋白复合体形成和亚细胞定位也对GSK3β的活性有重要的调节作用[5-6]。

2 GSK3β参与调控视网膜疾病

2.1 DRDR是糖尿病最常见的并发症之一，血-视网膜屏障(BRB)的结构破坏和通透性增加是DR的重要病理改变。BRB是由内皮细胞(ECs)和周细胞组成的内屏障以及视网膜色素上皮(RPE)细胞组成的外屏障共同构成。研究表明，ECs间黏附分子的完整性是BRB内屏障功能完善的关键因素，GSK3β可以介导ECs过度增殖及黏附连接破坏最终导致血管渗漏从而参与调控DR的病程发展[7]。在高血糖刺激下，GSK3β被VEGF/p38α/MAPK通路磷酸化失活，失活的GSK3β不能泛素化降解β-catenin，使得β-catenin积聚在细胞质并转移到细胞核中，这一方面使得ECs紧密连接和黏附连接蛋白复合物遭到破坏，另一方面促使β-catenin作为共转录因子激活与细胞迁移和增殖相关的各种基因，如uPA/uPAR，两方面共同作用，引起ECs过度增殖和细胞连接松散，导致细胞旁通透性增加和血管渗漏，BRB功能受损[8-9]。

近年来有研究表明，在DR中，神经变性先于视网膜微血管病变发生，而突触功能障碍被认为是神经病变恶化的第一步[10]。GSK3β介导线粒体受损使得微管功能障碍，使得依赖于微管运输的突触传递不能完整有效地进行，最终导致神经细胞功能障碍和丢失，介导DR神经突触损伤。Shu等[11]使用高脂饮食诱导的糖尿病小鼠模型揭示了在DR发病初期，异常GSK3β激活可导致β-catenin下调，通过抑制活性氧自由基(ROS)清除酶触发氧化应激，从而驱动线粒体损伤，最终导致视网膜神经节细胞(RGCs)的突触变性。而人参皂苷Rg1可通过IRS1/Akt信号通路抑制GSK3β活性，逆转微管结构不稳定和轴浆运输障碍，有效预防tau过度磷酸化介导的RGCs突触变性[10-12]。相似的研究显示，GSK3β活性可被GLP1R/Akt通路抑制，阻止过度磷酸化的tau触发的视网膜神经元突触变性[13]。突触变性进一步继发胞体功能障碍导致RGCs凋亡，而有研究证实，GSK3β可直接参与RGCs的凋亡调控。Szabadfi等[14]在糖尿病大鼠模型中发现，垂体腺苷酸环酶活化多肽通过增加GSK3β的磷酸化水平来降低RGCs凋亡。进一步的研究提示，GSK3β通过激活下游的重要抗氧化应激反应元件转录因子E2相关因子2(Nrf2)参与抵抗高糖小鼠视网膜内氧化应激损伤，减少甚至逆转氧化应激介导的RGCs凋亡[15-16]。

2.2 SMDSMD包括非渗出性SMD和渗出性SMD两种类型，是老年人视力损伤的主要原因。非渗出性SMD以RPE细胞的功能障碍和凋亡继而形成玻璃膜疣为特征。GSK3β可以通过多种机制介导RPE细胞的功能障碍和凋亡，促进非渗出性SMD发病。Ebrahimi等[17]的研究发现，小鼠在暴露于SMD的致病危险因素后，其视网膜中GSK3β的组成性活性升高，使得Wnt和Nrf2在双向反馈回路中同时下降，阻止细胞的抗氧化应激反应，使得RPE细胞走向凋亡。而Baek等[18]的研究表明，GSK3β通过NK1R/Akt生存通路失活后，可促进细胞增殖并激活细胞存活信号来抑制RPE细胞凋亡。另外一些研究报道，间充质干细胞条件培养基可以通过激活SIRT1/Akt/GSK-3β/β-catenin信号传导，阻断RPE细胞凋亡途径，治疗脑室内Aβ1-42注射诱导的大鼠SMD[19]。另一篇研究中也指出，GSK3β可以介导代谢信号的转导和转录因子的激活来降低视网膜中过度磷酸化的tau毒性，从而阻止高磷酸化的tau从微管中解离，减少RPE细胞凋亡。此外，GSK3β是细胞凋亡和细胞自噬的汇合点，通过持续的自噬减少细胞毒性以维持细胞存活，或者在自噬无法抑制细胞毒性的情况下启动凋亡以减少细胞毒性因子的释放[20]。

综上，动物和细胞模型中的实验结论表明，干预GSK3β相关通路可以通过抑制RPE细胞凋亡保护视网膜功能，然而这并不能有效抵抗SMD的进展，当RPE细胞数量进一步减少时，患者视力将发生严重下降，因此，寻求更有效的方法维持甚至重建RPE细胞的数目平衡将对SMD晚期患者视力恢复具有重大意义。自体RPE细胞移植是治疗视网膜变性疾病的一种主要方法，但在SMD患者中，自体RPE细胞由于自身基因及环境导致衰老及功能失调，活力低下，难以逆转视功能障碍。而研究表明，抑制GSK3β可以通过阻断细胞分化的进程，激活细胞增殖状态，使得RPE细胞获得“恢复活力”的潜力，同时不会损害RPE细胞的特异性表型及形态[21]。此外，干细胞来源的RPE细胞移植是SMD的一种新的治疗方法，抑制GSK3β可以高效诱导视网膜祖细胞分化为RPE细胞[22]。

渗出性SMD以脉络膜新生血管(CNV)穿透RPE屏障生长，破坏视网膜结构为主要特征，另外，GSK3β参与介导病理性新生血管的形成并促进发生渗出性SMD。Wang等[23]利用ARPE-19细胞和RF/6A恒河猴脉络膜-视网膜ECs的共培养系统发现，在缺氧条件下，ARPE-19细胞中的GSK3β受到组织因子的刺激后，可以通过激活Wnt/β-catenin信号通路上调血管内皮生长因子(VEGF)的表达，从而促进脉络膜和视网膜血管ECs的迁移，引发CNV。当前的抗新生血管治疗主要是以VEGF为靶标，但是，单纯抗VEGF的血管新生作用仍远远不能满足临床需求。最近的研究发现，血小板衍生生长因子(PDGF)家族可能是抗血管生成治疗的新靶标，在多种视网膜细胞中均表达的PDGF家族可以激活Akt并增加GSK3β的Ser9磷酸化和Tyr216去磷酸化，促进视网膜及脉络膜新生血管的形成[24]。另一方面，血管生成是缺血组织恢复血流灌注的代偿性表现，然而这些功能缺陷的新生血管无法从根本上缓解缺血缺氧对组织的损害，相反会导致更多的病理性新生血管形成和视网膜损伤。而有研究显示，通过抑制GSK3β可促进功能完善的新生血管形成，在不抑制新生血管形成的情况下减少血管功能缺陷，从根本上减少组织的缺氧损伤，为CNV提供了一种新的有前途的治疗策略[25]。

2.3 青光眼青光眼是由于RGCs的进行性死亡引起的一种神经退行性疾病，最终导致不可逆的视力丧失。眼压(IOP)升高是青光眼中RGCs损伤的主要危险因素，正常IOP的维持取决于房水分泌及排出的速率，有研究使用非色素性睫状上皮衍生的细胞外囊泡(EVs)作用下的正常小梁网细胞模拟人眼引流系统，显示在高EVs剂量下，GSK3β的活性被激活的Wnt信号抑制，引起细胞质中β-catenin的积累以及Pro-MMP9和MMP9活性的显著增强，影响房水引流的阻力，从而调节房水分泌与吸收之间的平衡，以维持正常的IOP[26]。研究表明，IOP持续升高时，GSK3β诱导线粒体动力相关蛋白表达，继而诱导线粒体分裂，过度的线粒体裂变会导致电子传输链受损，从而引发RGCs和RPE细胞死亡[27]。进一步的研究发现，由高IOP引起的缺血使得视网膜中的PI3K/Akt途径被阻断，导致生存蛋白Akt的去磷酸化和促凋亡蛋白GSK3β的激活。当IOP降低时，血管再灌注会通过磷酸化激活Akt，从而使GSK3β失活逆转细胞损伤[28]。此外，对于无明显IOP升高的正常IOP青光眼(NTG)，目前临床治疗主要是控制IOP，但是效果十分有限，单纯降低IOP无法有效阻止RGCs的进行性死亡。有研究表明，GSK3β可以通过被E-LPs去磷酸化来保护NTG小鼠视网膜及原代RGCs免受由谷氨酸诱导的Ca2+升高的损伤，从而抑制线粒体功能障碍并阻止RGCs凋亡[29]。

有研究发现，GSK3β还可以参与调节神经胶质细胞的干细胞特性，使得视网膜在遭受打击后可以自我修复，从而逆转RGCs进行性丢失引起的视力损害。Yao等[30]的研究表明，成年哺乳动物视网膜中的GSK3β活性被抑制后，可以促使β-catenin结构维持稳定并与下游的启动子结合从而激活转录，刺激Müller细胞增殖以及获得向神经元分化的神经源性潜力。因此，在视网膜损伤后，如何靶向GSK3β启动神经胶质细胞向RGCs分化，将成为未来青光眼神经保护研究的重要课题。

2.4 增生性玻璃体视网膜病变增生性玻璃体视网膜病变(PVR)是一种复杂的纤维化疾病，常发生在视网膜脱离手术后，其特征在于视网膜上增殖膜的形成和牵拉。RPE细胞在受到多种细胞因子和生长因子刺激后，通过上皮-间质转化(EMT)的过程而去分化并转化为成纤维细胞和成肌纤维，GSK3β被认为是该过程的负调节剂。Zhang等[31]的研究显示，在新西兰兔的PVR模型中，RPE细胞中的GSK3β表达下调，Wnt/β-catenin和PI3K/Akt信号通路的激活导致进一步的成纤维细胞增殖，胶原蛋白合成和EMT进展。另有研究表明，GSK3β在受到PVR患者玻璃体中含量丰富的TGF-β2刺激后磷酸化水平下调，参与促进ARPE-19细胞的EMT进程[32]。Huang等[33]的研究显示，GSK3β的活性形式GSK3β-S9A和PI3K/Akt抑制剂处理ARPE-19细胞可中断细胞转化和迁移以及胶原蛋白的收缩，减缓PVR的进程。

2.5 视网膜色素变性视网膜色素变性(RP)是一组遗传性视网膜神经退行性疾病，由于感光细胞的功能障碍和死亡，最终导致严重的视力障碍。RP的发病机制尚不清楚，有研究提示，GSK3β可以通过介导氧化应激、兴奋性毒性和炎症反应诱导细胞凋亡，参与介导RP的病理过程。Lavoie等[34]在GSK3β+/-小鼠中观察到视网膜电图异常，证实感光细胞功能与GSK3β表达之间的关联。进一步的研究表明，GSK3β受到IR/PI3K/Akt信号通路的调控而失去活性，从而维持感光细胞线粒体的完整性及促进Müller细胞的糖原合成，以应对正常程度下的氧化应激损伤，有效保护RPE细胞功能[35-36]。Wyse等[37]的研究也发现，PKA依赖性的GSK3β失活通过激活CREB上调Bcl-2，提高感光细胞的抗氧化应激能力。Wang等[38]和Carullo等[39]在RP10小鼠模型中发现GSK3β抑制剂可以通过减少变性视网膜中促炎性标志物α2m、IL-1β和TNF-α的释放以及减轻由N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)引起的兴奋性毒性来抑制感光细胞的死亡。

2.6 外伤性视神经病变外伤性视神经病变通常是由于钝性眼外伤和颅面损伤引起的视神经(ON)的直接或间接损伤。ON由RGCs的轴突形成，具有单向轴突的特性。对ON的机械破坏会导致RGCs死亡，最终导致视力丧失。研究发现，在小鼠ON夹伤模型中，GSK3β可通过调节生长锥动力学来促进轴突生长和分支及神经元极化[1,40-41]。进一步的研究表明，RGCs通常由于轴突生长锥的生长环境抑制及其进入轴突再生程序的内在能力不足而无法再生受损的轴突。GSK3β促进轴突再生的作用不是直接启动轴突再生以弥补丢失的轴突，而是通过消除影响轴突再生的抑制环境，从而使得轴突正常顺畅地完成其再生进程而不影响RGCs的存活机制[3]。Kondo等[42]的研究也发现，GSK3β-/-主要以去抑制方式起作用来促进ON再生，活性GSK3β介导的CRMP2磷酸化可将CRMP2灭活，从而取消CRMP2对微管聚合的促进作用和对轴突再生的去抑制作用，使得ON无法再生。研究已经证实，神经元极性是一个神经突迅速长成轴突，其余神经突分化成树突的过程，是神经网络定向信息流的先决条件，在视神经再生中起着重要作用。Huang等[43]利用原代培养的RGCs发现，GSK3β在受到Sema3A/PKA通路的调控后其磷酸化水平下降，使得下游CRMP2的稳定性受到破坏，从而抑制RGCs的轴突生长，促进树突生长，这不利于ON损伤的早期恢复。另有研究表明，磷酸化的GSK3β不仅可以通过激活MAP1B来减少微管蛋白的脱酪氨酸作用，调节轴突生长锥中的微管动力学，促进轴突生长，还在一定程度上参与调节轴突的最终成熟及其末端向大脑皮层投射的准确定位[3]。

3 总结与展望

近几年来，GSK3β在介导视网膜疾病中的调控作用研究已有一定进展。虽然基于细胞通路调控的治疗方法已经取得了一定的效果，但它未能逆转退行性过程，因为大多数治疗措施只关注单一通路的变化，忽视了疾病的进展是细胞状态和组织环境综合作用的结果。此外，单一途径的干预也可能干扰与其相关的其他生命过程，由此产生的副作用不应被低估。因此，未来的研究应该聚焦于GSK3β在视网膜疾病进展过程中的联合作用，针对GSK3β的药物研发应该考虑到不同通路的综合作用，从而实现对靶点的精准控制。