糖尿病视网膜病变免疫机制的研究进展△

刘自强 接传红 王建伟 邓 宇 李媛媛

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，是我国工作年龄人群中排名第一位的可预防性致盲性疾病[1]。既往多数研究认为，DR的病理过程主要包括周细胞丧失、内皮细胞增生、基底膜增厚、管腔狭窄或闭塞、视网膜缺血缺氧、血管新生等[2]。近年来，有学者发现DR患者血清中存在多种自身抗体，如抗醛缩酶抗体和抗周细胞抗体等[3-4]，抗生素、免疫抑制剂和皮质类固醇药物治疗DR的有效性表明[5]，免疫系统失调和炎症是DR病理生理学的重要因素。因此，本文从血-视网膜屏障(BRB)、小胶质细胞、补体系统、细胞因子等方面进行综述，探讨免疫机制在DR血管病变和神经变性中的作用。

1 BRB

视网膜受高度复杂免疫机制的保护，BRB作为视网膜与人体免疫系统间的一道天然物理屏障，是视网膜免疫防护的第一道防线。BRB由血-视网膜内屏障(iBRB)和血-视网膜外屏障(oBRB)组成。其中iBRB由视网膜内皮细胞间的紧密连接构成，oBRB由位于Bruch膜上的视网膜色素上皮(RPE)细胞之间的紧密连接构成[6]。BRB将视网膜与外源性病原体隔离，使组织与全身免疫系统避免免疫监视，为视网膜提供第一层免疫保护，一旦BRB被突破，则触发视网膜免疫抑制，启动第二道、第三道免疫防护[7]。

在DR中，由于广泛的BRB损伤，视网膜免疫特权被破坏，免疫耐受性大幅度降低，免疫偏离功能丧失，大量循环免疫细胞浸润视网膜，激活先天性免疫或获得性免疫，导致视网膜血管和神经元的进行性退化[8]。BRB可能通过以下途径参与DR的免疫学发病：(1)BRB的损伤导致血浆成分外渗和脂蛋白修饰，引起自身抗体合成，进而导致免疫复合物的形成。DR中免疫复合物形成与周细胞丢失、白细胞淤滞、巨噬细胞活化等有关[4]。(2)在DR的早期阶段，视网膜周细胞抗体可能与周细胞表面抗原发生反应，通过激活补体系统诱导周细胞损伤，导致iBRB的破坏[9]。同时，iBRB的破坏使免疫球蛋白和补体因子进入视网膜周细胞，诱导细胞毒性效应，导致视网膜血管和神经的进一步损伤。(3)高血糖下视网膜的BRB被破坏，周细胞表达II型胶原蛋白增加，II型胶原蛋白与免疫活性细胞直接接触，激活自身免疫机制，诱发DR的发生发展[10]。Nakaizumi等[11]发现，DR患者血清中II型胶原蛋白IgG抗体水平显著高于非炎症性眼病患者。Balashova等[12]亦报道了DR患者的血清和泪液中II型胶原蛋白抗体和免疫复合物水平增高。

2 小胶质细胞

小胶质细胞是中枢神经系统(CNS)中先天免疫系统的吞噬细胞，视网膜和视神经作为CNS眼部的外延，小胶质细胞在眼病的免疫学发病中扮演着重要角色[13]。小胶质细胞主要位于视网膜神经节细胞(RGC)层、内丛状层、外丛状层，作为免疫细胞参与免疫反应，维持视网膜内稳态[14-15]。在高血糖、缺血、缺氧、血脂异常等环境下，小胶质细胞异常激活，由分枝状转变为阿米巴状，进一步发生增殖、迁移和极化，发挥着保护和损伤视网膜组织的双重作用[14]。

近年来，DR中小胶质细胞的激活已通过基础和临床研究得到证实。早期实验研究发现，链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠发病4个月后，视网膜各层小胶质细胞密度明显增加，且分枝状突起变厚变短，小胶质细胞呈激活状态[16]；另一项研究也发现，糖尿病大鼠视网膜中激活的小胶质细胞数量明显增加，表明其增殖、迁移能力增强[17]； Arroba等[18]在5周龄DR小鼠模型视网膜内核层中发现了活化的小胶质细胞，并检测到双免疫阳性细胞的增加，表明小胶质细胞在DR的早期阶段就表现出M2抗炎表型。在人类视网膜中，小胶质细胞激活存在于DR的不同阶段[19]。Zeng等[19]使用HLA-DR抗原、CD45或CD68抗体对不同阶段DR患者视网膜中的小胶质细胞进行免疫标记，发现在DR的不同阶段小胶质细胞数量均明显增多，并呈肥大状态，且在部分黄斑囊样水肿患者的视网膜中，小胶质细胞浸润到视网膜外部和视网膜下间隙中； Scott等[3]使用多西环素治疗轻中度非增生型DR(NPDR)患者、Cukras等[20]使用米诺环素治疗DR患者，均取得了较好的临床疗效。而多西环素、米诺环素均属于抑制小胶质细胞活化的药物，亦从侧面证明小胶质细胞激活在DR发病中扮演着重要角色。

小胶质细胞可能通过以下途径参与DR的发生发展：(1)小胶质细胞通过吞噬RGC，造成其丢失[14，21]。Anderson等[22]通过实验发现，小胶质细胞通过结合补体受体3，吞噬非凋亡新生RGC，来调节胚胎小鼠的RGC密度。Bai等[23]发现，醛酮还原酶1可通过激活核因子κB(NF-κB)通路诱导小胶质细胞活化，进而抑制RGC的活性并促进其凋亡。(2)小胶质细胞分泌细胞毒性物质、炎症因子介导RGC的凋亡和死亡。Altmann等[24]认为，活化的小胶质细胞通过激活NF-κB和细胞外信号调节激酶信号通路，释放细胞毒性物质和炎症介质，介导RGC凋亡。(3)小胶质细胞通过破坏BRB的结构和功能，参与DR的发病。还有研究表明，小胶质细胞通过改变视网膜内皮细胞间的紧密连接蛋白、诱导内皮细胞和周细胞的丢失等途径破坏iBRB，从而在DR发病中发挥作用[25]。Yun等[26]在小鼠视网膜上发现小胶质细胞通过分泌白细胞介素(IL)-6诱导STAT3通路的激活，降低紧密连接蛋白ZO-1和occludin的表达来增加小鼠视网膜内皮通透性。目前关于小胶质细胞在oBRB中的作用尚不完全明确。Jo等[27]在不同类型的DR小鼠模型中观察到小胶质细胞在RPE层的聚集，提示激活的小胶质细胞可能以跨RPE细胞的方式向视网膜外迁移。该团队进一步发现IL-6处理的小胶质细胞分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)，进而通过激活NF-κB通路降低RPE细胞中ZO-1的表达，从而破坏DR中的oBRB。(4)小胶质细胞诱导视网膜新生血管形成[15]。Boeck等[28]在氧诱导视网膜病变 (OIR) 的小鼠模型中发现具有增殖和迁移表型的小胶质细胞在视网膜的缺血和新生血管区域聚集。Xu等[29]使用OIR小鼠视网膜冷冻切片进一步研究发现，阿米巴状小胶质细胞存在于表层和神经纤维层中，与新生血管形成密切相关。

3 补体系统

补体的发现可以追溯到19世纪末， Ling等[30]在血液中发现了一种未知的不耐热的裂解物质，它对各种细菌具有活性，后被命名为补体。补体系统由30多种血浆蛋白、膜结合受体和调节蛋白组成，是非特异性先天免疫反应的重要组成部分。大多数血清中的补体是无活性的酶原状态，通过经典途径、替代途径和凝集素途径被激活，激活后表现出明显的生物活性。

研究表明，DR中的视网膜血管损伤与补体系统激活密切相关[8]。Gerl等[31]发现，DR患者的Bruch膜、脉络膜毛细血管含有较高水平的C3d和C5b-9复合物，同时具有膜攻击复合物的沉积；Laura等[32]发现高浓度的补体C3与DR的风险增加有关； Xu等[33]发现补体C5基因多态性与PDR具有相关性。

补体系统激活可能通过以下途径促进DR的发生发展：(1)经典途径：目前缺乏对DR患者视网膜中经典途径蛋白的检测，故对经典途径在DR发病机制中的作用研究相对较少。García-Ramírez等[34]研究发现，PDR患者玻璃体中C4b、C3、C9、因子B相关补体蛋白明显高于非糖尿病患者，其中对C3、因子B进一步行蛋白免疫印迹实验，与RT-PCR定量定时测定mRNA表达结果一致，说明DR发病与经典途径补体激活有密切联系。孙洪岩等[35]发现，C4在DR患者血清中呈高表达，推测DR病理进程中有补体所诱发的炎症反应和经典途径补体系统的激活； Huang等[36]通过实验发现，糖尿病小鼠外泌体中缺乏IgG会导致视网膜血管损伤减少，并进一步通过C1激活实验推测血浆中载有IgG的外泌体可能通过结合C1复合物，使C1复合物蛋白水解被激活，从而激活经典补体途径，导致下游视网膜血管损伤。(2)替代途径：DR患者中存在补体替代途径早期阶段被过度激活，表明补体介导的炎症可能有助于加速DR[37]。在人类和小鼠糖尿病研究中已经证实，补体系统的两种膜结合抑制剂CD55和CD59的水平降低，这些发现表明DR中存在补体替代途径的激活[38]； Mandava等[39]研究发现，PDR患者玻璃体内16种补体成分水平显著高于非糖尿病患者，其中C3a/C3、C5a/C5和Ba/因子B的比率较对照组更高，C3、C5和因子B的局部和眼内激活表明PDR患者补体替代途径的激活。(3)凝集素途径： Geng等[40]通过横断面研究发现，DR患者血清甘露糖结合凝集素(MBL)水平高于健康受试者，且MBL水平随着DR严重程度的增加而升高，提示补体凝集素激活途径参与DR的发生； Holt等[41]发现，血清中凝集素途径蛋白MAp44、MASP-2高水平与DR相关，同时高水平的H-ficolin与单纯视网膜病变的发生相关，提示凝集素途径补体激活在DR的早期阶段可能起着更为突出的作用。

4 细胞因子

细胞因子是由免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导多种细胞合成并分泌的具有广泛生物学活性的低相对分子质量的蛋白或多肽[42]。众多细胞因子在机体内相互促进或相互制约，形成复杂的细胞因子免疫调节网络。高糖环境刺激局部和全身炎症因子和趋化因子的表达增加，其导致的持续轻度炎症被认为促进了DR血管和免疫系统的相关损伤，诱导BRB的破坏，进一步导致黄斑水肿和视网膜新生血管的形成[43]。

4.1 ILIL最初定义为传递免疫信号，在调节免疫系统的增殖、活化，免疫信息的调节和传递，调控机体的炎症反应中起着关键性的作用，目前在DR的发病中IL-6和IL-1β研究相对较多。研究发现，糖尿病大鼠、DR患者中均有IL-6表达的升高[44-45]。且有研究表明IL-6是炎症性血管渗漏的关键介质，通过直接或间接影响血管内皮细胞在DR的发病中发挥作用[46]。Valle等[47]发现，IL-6转信号通路通过诱导细胞间黏附分子-1表达的上调，导致iBRB的破坏； Yun等[48]通过体外实验发现，IL-6通过降低紧密连接蛋白ZO-1和occludin的表达，激活视网膜内皮细胞中的STAT3信号通路，增加小鼠视网膜内皮的通透性和血管渗漏；此外，IL-6可诱导血管内皮生长因子(VEGF)的产生，并促进新生血管的生成， Zhou等[49]亦发现IL-6水平与PDR患者的新生血管程度呈正相关。多项研究表明，IL-1β通过诱导血管渗漏、促使血管收缩和神经变性，已成为DR发病早期的重要炎症因子[50]。在2月龄啮齿动物的视网膜和早期DR患者体内，IL-1β表达均上调[51]。同时，向非糖尿病大鼠玻璃体内注射重组IL-1β，可促进视网膜毛细血管细胞的氧化应激和凋亡，而这正是DR的组织病理学特征[52]。另外，IL-1β可通过激活NF-κB信号通路促进IL-6等炎症因子表达上调，引起一系列炎症反应[52]。除了其有效的促炎能力外，IL-1β 还可以通过诱导新生血管的形成促进PDR的发展， Stahel等[53]在PDR患者中使用canakinumab (Ilaris) 抑制全身IL-1β，发现可适度消退新生血管，血管渗漏和黄斑水肿也持续减轻。

4.2 肿瘤坏死因子TNF-α是由巨噬细胞和单核细胞分泌的一类炎症因子，在DR的发病中起着重要作用。DR患者玻璃体液、房水甚至泪液中TNF-α含量高于正常水平， Feng等[54]发现5年和10年DR组房水中TNF-α水平高于对照组，并与DR的病程和严重程度呈正相关。Amil-Bangsa等[55]通过横断面研究发现泪液中TNF-α含量亦与DR严重程度相关。体外和体内研究表明，TNF-α通过增加白细胞对视网膜内皮细胞的黏附，增加BRB的通透性，从而在DR的发病中发挥作用。Aveleira等[56]发现TNF-α通过PKC/NF-κB途径降低视网膜内皮细胞中紧密连接蛋白claudin-5和ZO-1的表达并改变其分布，从而导致通透性增加；同时TNF-α的基因变异可能增加DR发生的风险， Gao等[57]通过荟萃分析发现，TNF-α基因中的-308 A和-238 A等位基因可能增加DR发生的风险，并在不同种族中具有差异。

4.3 趋化因子趋化因子是一个小肝素结合蛋白家族，在机体中主要发挥免疫监视和炎症作用。研究表明，趋化因子通过介导炎症、激活信号通路以及促进新生血管的形成等方面发挥在DR发病机制中的作用[58]。单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)是CC趋化因子家族的重要成员，多项临床研究表明MCP-1在DR患者房水、玻璃体液和血清中含量增高，且与病情的严重程度呈正相关[59-60]。Dong等[61]在啮齿动物DR模型中发现，MCP-1表达上调发生于DR的早期阶段，通过激活视网膜小胶质细胞，从而触发免疫反应和轻度炎症反应； Tonade等[62]发现野生型糖尿病小鼠通过释放MCP-1，改变视网膜内皮细胞间紧密连接，破坏iBRB；同时，MCP-1附着在受体CCR2上，通过募集和累积单核细胞、巨噬细胞，使其聚集在视网膜血管内，引起视网膜毛细血管阻塞，导致血管渗漏及无灌注[58]；此外，遗传学研究表明，MCP-1基因多态性可能对DR的发病机制产生严重影响。Jiang等[59]发现MCP-1的-2518 GG基因型和G等位基因与中国汉族人群PDR风险增加有关。Wang等[63]通过荟萃分析进一步证明了上述结果。

DR的发病还与CCL3、CCL5、CCL21、CX3CL1、CXCL16等多种趋化因子相关。 Zeng等[64]发现PDR患者玻璃体液中多种趋化因子浓度高于对照组，其中趋化因子CCL3与DR早期视网膜损伤机制相关，CCL5和CCL21与PDR中纤维血管膜的形成有关； El-Asrar等[65]亦发现PDR患者玻璃体样本中CXCL16、CX3CL1水平均显著增加。

5 小结

综上，免疫系统失调和炎症是DR发生发展的重要因素，其中BRB是视网膜的第一道免疫防线，小胶质细胞具有保护和伤害视网膜的双重作用，补体系统的损伤程度与DR进展呈正相关，多种细胞因子相互作用影响免疫调节。目前治疗DR的主要方法有视网膜激光光凝术、玻璃体内注射抗VEGF药物、皮质类固醇类药物、玻璃体切割术等，但均存在诸多局限性。因此，认清DR发病的本质才是解决DR的根本方式。近年来，免疫机制研究成为DR研究热点，但是免疫机制在DR中发挥的具体作用还有待深入研究，进而为临床治疗DR提供新的依据和策略。