间充质干细胞在特发性肺纤维化治疗中的应用

段春艳 ，高凌云，2△

(1.电子科技大学医学院，四川 成都 610054；2.四川省人民医院·四川省医学科学院东院，四川 成都 610101)

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是间质性肺病(interstitial lung disease, ILD)中最常见的一种疾病，占所有ILD病例的17%～86%[1]。目前临床治疗IPF的方案包括抗纤维化药物、糖皮质激素、肺移植等[2]，这些方案治疗效果并不明显，还可能带来严重的副作用。当前IPF患者的生活质量低下，亟待安全、有效、方便的治疗药物来改善IPF患者的预后。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的多功能性及其调节免疫、抑制炎症和促进上皮组织修复的能力促使MSCs快速在IPF治疗中的应用。本文综述了IPF的流行病学及发病机制、MSCs体外移植治疗IPF的临床前研究和已知结果的临床研究，并分析提高MSCs治疗效率策略，以指导设计未来的临床研究，来治疗这一病因复杂的疾病。

1 IPF的流行病学及发病机制

IPF是一种与肺组织结构重塑和成纤维细胞过度沉积有关的慢性肺部疾病，具体发病机制至今不明。据统计，1998～2010年，在英国因肺纤维化住院的患者以大约每年5%的速度在增长，平均发病年龄为66～71岁，老年男性最为多见[3]。IPF全球发病率为(0.09～1.30)/10万，流行率为(0.33～4.51)/10万[4]。IPF的发病率和死亡率均呈上升趋势，全球IPF患者约500万人，患者诊断IPF后，如果不经治疗，平均预期寿命不超过5年，死亡率超过了许多恶性肿瘤[1]。

虽然IPF机制尚未阐明，但已有的研究对其病因的理解是在损伤等病理环境中肺泡上皮细胞反复损伤后致肺间质细胞成分的改变。肺泡上皮细胞功能障碍被认为是IPF 发病的关键步骤，IPF上皮细胞损伤后的异常修复反应是疾病发生的一个重要机制。肺纤维化发病的关键步骤是肺泡上皮细胞损伤后无法执行自身的修复功能障碍，进而分泌大量的促炎因子及致纤维化细胞因子造成间质中成纤维细胞增殖活化、巨噬细胞极化状态改变，促进成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，形成支持纤维形成的正反馈环，不断促进纤维细胞灶的形成和细胞外间质(extracellular matrix, ECM)过多沉积以及异常上皮-间充质转变(epithelail-mesenchymal transition, EMT)和内皮-间充质转化，最终导致正常肺泡结构破坏、持续的组织重塑与永久性纤维瘢痕的形成[5]。

2 MSCs治疗肺纤维化现状

2.1 MSCs体外移植治疗肺纤维化临床前研究现状近年来，以干细胞治疗为核心的再生医学技术，尤其是MSCs，为人类难治性疾病的治疗带来了希望，同时也为MSCs移植治疗IPF提供了新的思路。MSCs可以从许多组织来源进行分离和鉴定出来，包括骨髓、脐带、脂肪组织及胎盘等。1995年，Haynesworth等[6]首次将MSCs作为细胞药物制剂进行临床应用。2003年，Ortiz等[7]首次发现MSCs可显著减轻小鼠肺纤维化。

大多数肺纤维化的动物模型中[8～10]，外源性MSCs移植治疗已经达到了预期的效果。 MSCs可减少肺组织炎症反应、胶原蛋白沉积和细胞外基质产生、降低了支气管肺泡灌洗液中炎症标志物、改善Ashcroft评分，提高了存活率，对急性肺纤维化有很大的治疗效果。当肺组织受损时，MSCs可被激活并被召集到受伤的肺组织，通过分泌生物活性分子和调节局部免疫反应，减轻局部炎症反应，抑制纤维增殖，增强内源性肺损伤抵抗力，从而建立了一个促进肺泡上皮再生的微环境。

以往关于MSCs可能治疗肺纤维化的机制为：当肺组织存在损伤时，MSCs可归巢至博来霉素诱导的小鼠肺损伤区域[7],在可溶性介质中的趋化因子基质细胞衍生因子-1与细胞膜表面的同源受体CXCR4的相互作用下，MSCs迁移到损伤和炎症部位[11]，并通过典型Wnt通路(糖原合成酶激酶3β和β-连环蛋白)和非典型 Wnt 通路(c-Jun氨基末端激酶和蛋白激酶C)分化为II型肺泡上皮细胞，发挥修复受损的细胞以减轻肺纤维化[12]。但新近学者通过命运追踪技术发现，MSCs的归巢很少见，并未通过向肺泡上皮细胞分化达到抗纤维化作用[13]。那MSCs究竟是如何发挥抗纤维化的作用呢？近年来，在体内外实验的研究种发现MSCs衍生的分泌组才是MSCs真正发挥抗纤维化的重要组成部分。MSCs来源的分泌物主要由可溶性蛋白、细胞外囊泡和细胞器构成，而研究最多的是细胞外囊泡其中的一个亚型-外泌体。外泌体是MSCs在静息或缺氧应激、凋亡、剪切力等因素刺激下分泌产生的小圆形膜片，直径在50～100 nm，包含mRNA、 miRNA 以及线粒体等，是促进细胞间信息交流的重要机制，具有明确的组织再生修复作用以及潜在的免疫调节、调控细胞生长分化等功能，是干细胞领域具有重要研究价值的新兴热点。外泌体可通过激活转化生长因子信号通路、Wnt/β-连环蛋白信号通路来调节上皮间质转化，调控单核细胞表型[14]，修复受损的上皮细胞与抑制肌成纤维细胞达到逆转肺纤维化的作用[15]。

其它关于MSCs治疗肺纤维化的可能的机制如下：①抗氧化应激：MSCs能有效降低博莱霉素致肺损伤后炎性氧自由基水平，改善超氧化物歧化酶、谷胱甘肽等氧化损伤指标，对肺组织具有保护作用[16]；②抗炎：MSCs主要是通过激活细胞分泌肿瘤坏死因子刺激基因6抑制核转录因子复合物向细胞核的激活和转运，减少促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α、白介素-1、干扰素γ和白细胞介素-6的分泌[17]；前列腺素E2与巨噬细胞上的前列腺素E2受体和前列腺素E4受体结合，促进巨噬细胞分泌抗炎性细胞因子白介素-10的表达。③免疫调节：MSCs降低巨噬细胞和树突状细胞CD80共刺激分子的表达和密度，降低其诱导抗原特异性T细胞免疫反应的能力； 通过Fas/FasL信号通路直接诱导活化T细胞凋亡，缓解异常过度免疫反应[18]；MSCs通过促进巨噬细胞向M2表型转化和减少来自巨噬细胞和树突状细胞的趋化因子的表达来调节免疫反应，进一步减少炎症细胞浸润和炎症相关细胞因子的含量[19]，减少B细胞的募集，维持肺部免疫平衡；④抑制EMT：MSCs可通过改变内质网应激与自噬作用，从而抑制EMT[20]；⑤减少促纤维介质的产生：降低促纤维化因子 Co11a1和 Co13a1的表达，达到减少肺纤维化进程的目的；抑制转化生长因子-β/SMAD-3信号通路的激活，从而抑制肌成纤维细胞的激活，进一步减少胶原等ECM的合成[21]；调节基质金属蛋白酶/组织金属蛋白酶抑制剂的比例来直接抵消纤维化过程[22]，从而减少胶原纤维的含量并抑制肺重塑；可通过增加巨噬细胞基质金属肽酶-9的表达以降解胶原蛋白。⑥旁分泌作用：MSCs通过分泌多种生长因子、趋化因子和受体实现免疫调节功能，这些生物活性分子调节局部免疫反应，重构了肺微环境，并抑制炎症和修复受损组织[23]。

大部分临床前研究探讨的是早期炎症阶段而不是纤维化晚期。研究发现，初始炎症期或纤维化早期注射MSCs后，可减少纤维化形成；而在慢性纤维化期注射MSCs后，可能加重纤维化，这可能与MSCs也能分泌转化生长因子β有关[24]。然而，Liu 等[25]研究发现，分泌较高水平转化生长因子-β的MSCs对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化却具有抗纤维化作用。

2.2 MSCs治疗临床研究现状临床前动物实验的数据结果令人兴奋，但将MSCs用于开展肺纤维化患者临床试验，比较担心MSCs安全性及有效性问题；担心MSCs会进一步加重肺纤维化的形成，而无逆转肺纤维化的作用；担心移植MSCs后肿瘤形成的可能性。

基于上述担心，这些问题已经在几个已经完成的临床试验中得到评估。全球范围开展的干细胞治疗肺纤维化临床试验多集中在I/II期，目前暂无上市获批产品。一项在澳大利亚进行的Ib期单中心非随机研究(NCT01385644)[26]，探讨静脉输注异体胎盘MSCs对IPF患者的治疗潜力，用1×106/kg、2×106/kg的MSCs分别治疗了4例中重度IPF患者，结果发现患者对这两种剂量的干细胞都耐受，只有轻微和一过性急性不良反应，但是随访6个月后，各项监测指标(包括用力肺活量、一氧化碳弥散量、6分钟步行试验和CT纤维化评分)均较基线无改变，并没有减轻肺纤维化。在另一个的Ⅰ期临床试验(NCT02013700)中[27]，将9例轻中度IPF患者分成3组，每组分别静脉输注20×106、100×106、200 ×106个骨髓MSCs，评估了单次静脉输注骨髓MSCs治疗IPF的安全性问题。随访期间，没有发生与治疗相关及急性严重不良事件，仅2例因IPF的进展而非与治疗相关的死亡发生，共有21例不良反应报告(最常见的不良记录是3例支气管炎和2例普通感冒)，在输注60周后，FVC预测值的平均下降率为3.0%，一氧化碳弥散量预测值下降率为5.4%。2020年发表在《干细胞转化医学》上的一项研究[28]首次揭示了对于肺功能迅速下降的IPF患者来说，高累积剂量的同种异体 MSCs(共计1.6×109个/例)治疗是安全和可耐受的，经治疗52周后接受MSCs组临床症状显著改善，无严重不良反应，但该临床试验发现试验组与对照组之间死亡率及高分辨率 X射线计算机断层成像纤维化评分无差异。一项随访时间长达60月关于IPF患者细胞治疗的纵向结果的研究[29]，该报告指出IPF患者接受支气管内输注脂肪间充质干细胞过程中，未发现与治疗相关的严重不良反应，但患者距离第一次给药2年后出现肺功能下降，患者总体生存率及疾病进展时间与已经发表的未经治疗IPF人群的流行病学以及与吡非尼酮和尼达尼布的大型III期随机对照试验的安慰剂组相似。一项I期多中心IPF支气管内自体骨髓MSCs临床试验(NCT01919827)发现3例患者的MSCs在培养后,检测到染色体畸变，MSCs的基因组不稳定可能会给IPF患者使用自体骨髓MSCs带来麻烦[30]。

目前尚未报道MSCs治疗肺纤维化相关的严重不良反应和与治疗相关肿瘤形成，但由于动物和人类的差异以及临床试验样本量小，该药物在人体中的安全性和有效性仍然值得怀疑和高度重视，需开展多中心的随机对照临床试验来证明 MSCs 治疗IPF患者的安全性及疗效。

3 提高MSCs治疗效率策略

第一代基于原代干细胞(如MSCs及其衍生物)的疗法，在过去数十年里，已被广泛应用于各种复杂性的疾病。然而MSCs治疗效果并未满足临床试验的要求，并且将MSCs成功运用于临床需要克服许多挑战，因此如何增强MSCs的功效以适应宿主微环境成为当务之急。直到最近几年，第二代基于干细胞的疗法-细胞工程技术的出现，才极大的扩展了MSCs治疗领域的应用范围并提高了MSCs的特异性及有效性。干细胞工程是通过体外培养MSCs、诱导MSCs定向分化、利用基因编辑技术(如成簇而规律地间隔短回文重复序列-Cas系统)对MSCs进行遗传修饰，使改造后的MSCs具有增强的归巢、效价或扩增能力。一项研究发现成簇而规律地间隔短回文重复序列-Cas9系统介导的可逆永生化小鼠骨髓基质干细胞具有MSCs的多功能特性[31]，这种工程化的MSCs可以作为原代MSCs的一个具有重要前景的替代来源，用于再生医学领域的基础研究和转化研究。此外还包括以下几种策略：①通过小分子、缺氧或生物材料对结构的刺激来启动MSCs，以细胞因子、生长因子、缺氧、药物、不同的生物材料、不同的培养条件以及其他不同的分子进行预处理，提高MSCs的存活增殖、迁移能力、免疫调节以及治疗效果[32]；②利用MSCs分泌组作为药物输送平台进行靶向治疗[33]，未来将MSCs分泌组作为无细胞药物靶向定位目标器官以进行治疗，将发挥极大的临床应用价值；③通过提供一种支持MSCs粘附的支架来改善MSCs生存能力和功能的生物材料。未来将有更多提高MSCs治疗效果的方式，MSCs疗效将进一步得到证实。

4 MSCs治疗肺纤维化当前挑战与展望

在过去几十年中，MSCs被广泛运用于临床。虽然各种动物疾病模型的临床前研究令人欣喜，但是否针对人体的慢性肺纤维化期，仍需要进一步探索和研究。将MSCs疗法用于多种人类疾病的注册临床试验尚未达到预期效果。成功应用MSCs治疗IPF患者仍需要克服许多挑战，主要挑战包括不同来源的MSCs的免疫相容性、稳定性、异质性、分化和迁移能力以及与宿主微环境的不一致性。应对MSCs治疗IPF患者的长期随访上,以确定MSCs治疗可能的致癌作用和能否逆转肺纤维化以提高IPF患者的生存率。在进行大规模临床试验之前，必须考虑影响MSCs在体内活性的重要因素，包括干细胞组织来源及细胞类型、供体和受体、给药途径、输注方式、剂量和给药频率，以及对MSCs的预处理，确定在哪个阶段的IPF患者是最应该接受哪种类型MSCs治疗以及药物之间的相互作用，以最大限度提高其治疗效果，同时减少潜在的副作用。MSCs有望是逆转肺纤维化的有效治疗手段之一。