健胃清肠合剂对不完全性肠梗阻大鼠肠黏膜免疫屏障功能影响的实验研究*

李彦龙，任彦彦，吕巧莹，徐中，张旭彤，李生财

1 甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050；2 庆阳市中医院；3 甘肃中医药大学；4 甘肃省中医药研究院

不完全性肠梗阻（incomplete intestinal obstruction）是肠腔内容物不能完全通过梗阻部位而出现阵发性腹部绞痛、腹胀、恶心呕吐、停止排便排气等急腹症表现的一类疾病［1］。本病后期可导致毒血症、休克及死亡，严重危害人类健康。治疗方法分为手术疗法与非手术疗法，在非手术疗法中，中医药治疗肠梗阻手段丰富，方法多样，临床疗效确切，具有安全持久、简便廉验等优点［2-3］。健胃清肠合剂是国家级名老中医廖志峰研制的院内制剂，前期相关研究发现该药治疗肠梗阻、便秘、胃肠胀气等疾病疗效可靠，安全性高［4-6］。临床发现健胃清肠合剂对胃肠黏膜有保护作用，该药对胃肠黏膜屏障的影响极可能是其发挥作用的重要机制。本研究采用ELISA法检测在不同剂量健胃清肠合剂作用下不完全性肠梗阻大鼠模型血清中炎性因子白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素10（interleukin-10，IL-10）及α-干扰素（interferon-α，IFN-α）的表达水平，研究健胃清汤合剂对大鼠肠黏膜免疫屏障功能的影响，为该药进一步的开发与推广提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级Wistar雄性大鼠112只，体质量（220±20）g，由甘肃中医药大学动物实验中心提供，实验动物许可证号：SYXK（甘）2015-0005。饲养条件：给予大鼠灭菌饲料及灭菌水正常饲养。本研究动物实验符合甘肃中医药大学伦理委员会制定的《有关动物实验指导原则》要求。

1.2 药物及仪器健胃清肠合剂（甘肃省中医院药物制剂中心，甘药制字Z11012103，规格：250 mL/瓶）；石蜡油（南昌白云药业有限公司；赣食药准字F20050005；规格：500 mL/瓶）。IL-6与IL-10试剂盒（联科生物公司）；IFN-α试剂盒（武汉云克隆科技股份有限公司，批号：88-7340）。PL-203型电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；Neofuge 15R型台式高速冷冻离心机（Heal Force）；DW-86L626型超低温冰箱（海尔有限公司）；FBZ2001-UP-P型纯水仪（青岛富勒姆科技）；TL-420D型水浴锅（姜堰市天力医疗器械厂有限公司）；移液器（大龙）：KA006318型300µL多道移液器（大龙）；YE3K030591型200µL移液器（大龙）；KE0012951型10µL移液器（大龙）；Epoch型酶标检测仪（BioTeK）。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制备参照文献［7］将大鼠用10%水合氯醛（2 mL/kg）腹腔注射麻醉，固定于鼠台，备皮，碘伏消毒，于腹中下l/3处开腹，暴露回盲部，用16 Go的中心静脉导管与回肠肠管并排放置，然后在距离回盲部l cm处使用圆针带7号丝线穿透肠系膜并绕过回肠肠管，将中心静脉导管与回肠肠管一并结扎，最后抽出中心静脉导管。造模成功标志：由于肠管梗阻，肠道食物无法顺利通过梗阻部位排出体外，所以造模大鼠每天粪便的干重减轻、颗数减少，造模大鼠能够排便但排便减少，说明已对大鼠造成不完全性肠梗阻，标志着造模成功。

1.3.2 动物分组遵从随机、均衡原则，采用随机数字表法将112只大鼠分为正常组，假手术组，模型组，阳性对照组，健胃清肠高、中、低剂量组共7组，每组16只。假手术组麻醉、开腹等方法同前，开腹后用中心静脉导管与回肠肠管并排置，并用针线穿透肠系膜绕过肠管但不结扎；正常组不做任何处理；其余各组大鼠制备不完全性肠梗阻大鼠模型。

1.3.3 药物制备健胃清肠合剂：该药临床上成人使用常规剂量约为2 mL/kg体质量［按人鼠面积比值公式计算（10 mL/kg）］。为方便实验时灌胃操作，将原药分别浓缩或稀释调配成含有原药浓度分别为3.3、1.65、0.825 mL/mL的混合液备用。石蜡油：按人鼠面积比值公式计算，将该药与蒸馏水按照体积比1∶1混合备用，灌胃时充分摇匀。

1.3.4 给药方法［8］健胃清肠各组均于手术造模前1 h，以及造模后第24、48、72 h灌胃给药，健胃清肠各组将对应浓度的健胃清肠合剂混合液按照10 mL/kg灌胃（高、中、低剂量组分别相当于成人常用剂量的10、5、2倍）；阳性对照组以调配好浓度的石蜡油-蒸馏水混合液充分摇匀后按照10 mL/kg灌胃；正常组、假手术组、模型组给予10 mL/kg的蒸馏水，时间同前。

1.3.5 血清制备于最后一次给药后1 h，脱颈处死大鼠，股动脉迅速放血5 mL左右，在自然温度下静置15 min，待血液凝固后置于离心机中，以离心半径8.6 cm，3500 r/min离心5 min，移取上层血清，制备血清。将制备完毕的血清标本置于-20℃超低温冰箱冷冻保存，集中待检。

1.4 观察指标采用ELISA法测定血清中IL-6、IL-10及IFN-α水平，具体测定步骤按照相应试剂说明书严格操作。

1.5 统计学方法采用SPSS 22.0统计软件进统计分析。计量资料以±s表示，两组间比较选用t检验，多组间比较选用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

与模型组相比，健胃清肠各剂量组大鼠血清中IL-6、IL-10及IFN-α水平均降低，尤以健胃清肠高、中剂量组降低明显，差异有统计学意义（P＜0.05）；且健胃清肠合剂高、中剂量组大鼠血清中IL-6、IL-10及IFN-α水平与阳性对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血清中IL-6、IL-10、IFN-α水平比较（±s） pg/mL

注：△表示与正常组比较，P＜0.05；▲表示与模型组比较，P＜0.05；★表示与阳性对照组比较，P＜0.05

组别正常组假手术组模型组阳性对照组健胃清肠高剂量组健胃清肠中剂量组健胃清肠低剂量组鼠数16 16 16 16 16 16 16 IL-6 3.91±3.20 4.33±3.35 9.45±3.97Δ 6.21±2.38 5.64±1.52▲★5.83±1.94▲★6.15±3.04 IL-10 24.36±8.44 26.17±9.63 31.60±14.21Δ 21.67±1.22 18.56±7.90▲★19.73±10.02▲★21.01±10.76 IFN-α 287.74±110.08 197.84±72.71 784.72±228.26Δ 542.95±279.64 509.16±248.70▲★459.99±175.13▲★642.78±370.63

3 讨论

中医学多将不完全性肠梗阻归属于“肠结病”范畴。中医理论认为六腑应以通降为顺，大、小肠均属于六腑，凡各种因素导致的肠道通降功能失调，滞塞不通，都会引发本病。中医治疗不完全性肠梗阻以“通里攻下、行气止痛、活血化瘀”为基本原则。健胃清肠合剂主要由大黄、木香、槟榔、枳壳、黄连、元明粉等药物组成，具有清热解毒、通里攻下之功效。临床研究表明，该药能够有效减轻不完全性肠梗阻患者腹痛、腹胀等症状，保护胃黏膜，加快肠道机械清除速度，减少术后肠漏、腹腔脓肿和伤口感染等并发症，降低术后肠粘连、肠梗阻的发生率，促进肠道功能的快速恢复，具有活血化瘀、抑菌消炎、提高机体免疫力等多重功效［9-11］。

肠道免疫屏障主要由集合淋巴小管、肠上皮淋巴细胞及肠固有层等肠相关淋巴组织构成，肠相关淋巴组织与肠道内分布的众多免疫细胞与免疫因子共同诱导机体产生免疫应答，发挥肠道免疫调节作用［12］。其中肠上皮淋巴细胞内的CD8+、CD4+细胞，在肠黏膜受到刺激时，数量增多，同时会促进分泌IL-6、IL-10及IFN-α等多种细胞因子产生细胞毒作用，以此对抗致病原，修复损伤的肠黏膜屏障，促进肠道的愈合［13-14］。肠梗阻时肠黏膜免疫屏障受到损伤，导致肠系膜相关淋巴结数量和功能出现异常，主要反应在肠系膜淋巴结的增殖和凋亡，从而影响其IL-6、IL-10及IFN-α等的表达。此外，这一屏障受损时，肠道菌群也会发生移位，逆侵入肠系膜淋巴结［15］。所以，肠梗阻时肠系膜淋巴结细胞凋亡增殖状况、肠道细菌移位量、血液中T淋巴细胞、淋巴细胞分泌入血的IL-6、IL-10、IFN-α等细胞因子能较好地反应肠道免疫屏障的受损状态。本实验通过检测IL-6、IL-10及IFN-α细胞因子的水平来反映健胃清肠合剂对不完全性肠梗阻大鼠肠黏膜免疫屏障的作用。

本实验结果显示，健胃清肠合剂能够有效降低不完全性肠梗阻大鼠血清中炎性因子的水平；其机制可能与该药能够抑制血清中炎性因子的产生和（或）释放、减少肠壁炎性物质渗出，减轻水肿、改善肠道血液微循环等相关。本课题组同时从生物屏障、化学屏障及机械屏障方面研究了健胃清肠合剂对不完全性肠梗阻大鼠肠黏膜屏障的影响，结果均表明健胃清肠合剂对不完全性肠梗阻大鼠肠黏膜几个屏障具有相应的保护作用，这种保护作用极可能是本药治疗不完全性肠梗阻除其泻下作用外显效的重要机制，但还有待进一步深入探究。