个体化肿瘤疫苗的作用机理及临床研究进展*

冯炜红 杜学明

天津市北辰医院肿瘤科 300400

肿瘤新抗原通常由肿瘤细胞基因组突变产生，仅存在肿瘤细胞，所以又称为肿瘤特异性抗原(Tumor specific antigen，TSA)。由于正常细胞不会产生和表达TSA，所以能被主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex, MHC)分子处理和提呈。T细胞识别出的突变位点被称为“新表位”[1]。然而，绝大多数已发现的突变抗原是每个患者特有的，寻找个体化的治疗靶点难以实现。二代测序(Next-generation sequencing, NGS)可以快速测序基因组，它与专用的生物信息学工具一起综合描绘一种癌症中的所有突变(统称为“突变组”)并预测MHC分子结合的新表位。然而，个体癌症患者的分析显示自发免疫应答仅针对其一小部分突变(<1%)[2]，使人们对突变的免疫原性产生怀疑。这导致了一个假设，即只有具有高突变负荷的肿瘤以及与之相应高度多样性的肿瘤反应性T细胞，才能有效进行新抗原免疫治疗。

1 临床前研究和个体化突变疫苗的临床翻译

为了明确哪一部分突变能够诱导新表位特异性免疫反应，Ugur Sahin等[3]给小鼠接种了长肽或抗原编码RNA，代表着同基因肿瘤中经NGS鉴定的50种突变，其中相当一部分突变是免疫原性并由肿瘤排斥反应介导[4]，大多数新表位(占随机选择突变的20%～25%)可以被CD4+T辅助细胞识别，用这些新表位进行疫苗接种可控制晚期小鼠肿瘤的生长。从同基因小鼠到人类的临床转化更为复杂，包括突变的识别、潜在新表位的预测以及疫苗的设计和制造。一般通过取得患者活检的肿瘤组织和正常组织(外周血白细胞)进行二代测序，获取肿瘤和正常DNA序列，可以确定肿瘤特异性的非同义单核苷酸变异或蛋白质编码基因中的突变插入或缺失，通过计算检查突变肽区域是否与病人的人白细胞抗原(Human leukocyte antigen,HLA)等位基因(基于预测的亲和力)结合，以及其他被认为与潜在疫苗靶点排序相关的突变蛋白特征，这些有助于选择多个突变以设计、制造独特的新表位疫苗。在一项试验中，3例黑色素瘤患者接受了体外加载的7种合成9-聚体肽的树突细胞(Dendritic cells,DCs)，这些肽代表每例患者预测与常见的HLA-A2结合的个体突变，21个肽中的9个检测到了疫苗诱导的CD8+T细胞免疫应答，对相应的免疫原具有特异性，然而该实验未评估对自体黑色素瘤细胞的识别，疫苗反应的相关性仍不明确。两个随后报告的临床试验加入了Ⅲ～Ⅳ期黑色素瘤患者，在一项试验中，6例患者皮下注射了长肽，代表着多达20个突变，每例患者同时使用佐剂[5]。在第二个试验中，13例患者注射了RNA，编码27聚体的10个[6]。两项研究中T细胞应答的诱导都需要患者抗原的提呈和处理，均显示总免疫原性率高达60%。而且在两项研究中，大多数疫苗诱导的T细胞应答都是新启动的，在疫苗接种前无法检测到。根据临床前发现，大多数新表位诱导了功能性CD4+Thelper1(TH1)细胞，无论在RNA试验(结合MHCⅠ类和Ⅱ类预测新表位选择)还是肽试验(仅依赖于MHCⅠ类结合预测)中，新表位特异性CD8+T细胞对RNA或肽疫苗的反应分别为25%和16%。在RNA试验中，多个CD8+反应具有很高的强度。两个试验都显示了对所选疫苗诱导免疫应答的自体肿瘤细胞系的识别。在两名接受RNA疫苗接种的患者中，有证据表明CTL浸润和肿瘤细胞被新表位特异性T细胞杀伤。

尽管队列规模较小，但这些研究为单独使用疫苗和随后联合使用检查点抑制剂的临床活性提供了依据。在RNA试验中，疫苗接种显著减少了13例高危黑色素瘤患者的疾病复发累积次数。其中1例患者因进展迅速而停止接种疫苗，并在随后的检查点阻断治疗后迅速完全缓解。在肽试验中，6例接种疫苗的患者中有4例在整个随访期内没有复发，而2例迅速进展，并在随后的抗PD-1治疗后实现了肿瘤完全消退。

2 使用新抗原刺激肿瘤免疫

合理免疫治疗的一个关键原则是恢复免疫系统的功能，即所谓的癌症免疫周期[7-8]。肿瘤排斥反应主要是由细胞毒性CD8+T细胞引起的，疫苗的方法依赖于潜在的MHCⅠ类表位，然而越来越多的数据表明，新抗原特异性CD4+T细胞对癌症免疫治疗的有效性起着至关重要的作用[9]。由于肿瘤突变组为MHCⅡ类新表位提供了丰富的来源，突变组疫苗有动员TH1 CD4+T细胞的潜能[4]。CD8+效应蛋白的主要作用方式是杀伤递呈同源抗原的细胞[10]，而CD4+效应蛋白具有更广泛的功能，包括协调各种细胞类型的获得性和先天性免疫系统[11]。CD4+T细胞可以诱导有效CD8+T细胞，不同区域的TH1 CD4+T细胞通过同源CD40配体/CD40受体相互作用激活DCs，DCs可以提呈肿瘤细胞释放的抗原。然后DCs成熟，产生白细胞介素12和化学诱导剂，并上调共刺激分子。这些情况与CTL针对肿瘤抗原持续的反应有关，肿瘤抗原是由肿瘤细胞死亡释放并交叉呈现的。多表位疫苗已被证明可同时驱动新抗原特异性CD8+和CD4+T细胞，通过协同作用，它们可以启动癌症免疫循环：在淋巴结疫苗反应的启动阶段，TH1细胞有效地辅助树突状细胞诱导有效的新表位特异性CTL，提高其向肿瘤的浸润能力，并能产生长期存活的记忆CD8+T细胞[12]。在肿瘤中，疫苗诱导的TH1 CD4+T细胞可通过作用于各种免疫细胞类型来促进炎症微环境[4，13]。IFNγ是TH1细胞的关键细胞因子，可以上调肿瘤细胞MHCⅠ类分子，以改善CD8+效应蛋白的杀伤作用。同时，通过诱导MHCⅡ类表达，以更易识别IFN-γ敏化肿瘤细胞，并被细胞毒性TH1 CD4+T效应蛋白直接杀伤。总之，通过促进肿瘤细胞死亡和新抗原释放供DCs摄取，结合免疫原性微环境，CD4+T细胞可以启动T细胞触发、扩增和抗原扩散的连续循环，从而扩大抗肿瘤T细胞的能力。

3 疫苗设计中的突变发现、新表位预测和靶抗原选择

3.1 突变发现 个体化肿瘤疫苗面临的一个关键挑战是精确定位肿瘤突变组，以便选择最适合的突变以获得最佳的免疫应答。NGS分析正在不断改进，临床应用需要标准的操作程序，以确保数据的可重复性、质量控制和隐私。通常，这些分析依赖于从单个肿瘤病灶中采集的用于常规诊断的小活检组织，因此序列数据可能不能代表肿瘤的完整克隆谱。另一个需要解决的问题是错误的突变测定，确定单个NGS数据集中真实突变的标准化算法，对于单核苷酸变异非常有效,这是最丰富的肿瘤突变类型，如果它们出现在一个表达的蛋白质中并且是非同义的，它们可以产生T细胞识别的新表位，其他可能相关的突变类型是基因融合或小的插入和缺失，它们可以导致高度免疫原性的移码[14]。除了这些明确定义的突变类别外，与癌症相关的表观遗传、转录、翻译或翻译后畸变特征较少，可能会产生新的表位，并大大扩展疫苗靶点的发现空间[15]。作为新抗原的癌症特异性和可用性很难用现有技术进行评估，目前正在研究中。

3.2 新表位预测 抗原的处理和呈递是一个复杂的、多步骤的过程。技术上的可行性和成本限制了可以被整合到药物产品中突变的数量。到目前为止，对于如何优选突变还没有达成共识，最低要求是突变基因在肿瘤中的表达及其可产生序列改变的表位，并能被提呈给MHCs。MHC肽复合物的稳定性被认为是比MHC结合亲和力更好的免疫原性预测因子。然而，目前可用的MHC肽稳定性预测算法仅覆盖少数MHC等位基因，且依赖于小数据集，只有一小部分突变肽被预测为人类MHCⅠ类等位基因的高亲和力结合物，是MHCⅠ类配体。MHCⅠ类的表达受突变基因转录水平的影响。一般来说，在哺乳动物细胞中，基因表达水平、翻译蛋白的数量、MHC配体的细胞表面密度、免疫识别和细胞裂解都是正相关的[16]，因此高表达可以在一定程度上补偿弱MHCⅠ结合，反之亦然。这表明新抗原优化可以通过兼顾预测的MHC Ⅰ结合力和突变的表达水平来实现[17]。表达水平可以通过NGS数据中包含变化的mRNA测序读数来挖掘，然而并不是每一个突变的MHCⅠ类配体均具有免疫原性，但目前的I类预测算法可以用于处理强免疫原性新表位[1，6]。

3.3 靶抗原选择 准确预测与MHCⅡ类结合的配体具有挑战性。MHC-Ⅱ结合变性蛋白质或被修剪的大肽，而MHC-Ⅰ则依靠预先生成的大小肽。由于MHC-Ⅱ分子的结合槽在两端都是开放的，因此肽的长度和结合域的定义较少，因而不易预测。根据亲和力预测临界值，HLAⅡ类结合评分<1、1～10或>10分别对应70%、45%或34%的突变诱发新表位特异性CD4+T细胞应答[6]。

4 个性化疫苗的临床应用

个性化疫苗的临床应用面临的一个关键挑战是个性化疫苗的快速生产和及时投放。疫苗生产的周转时间取决于疫苗的设计。个体化疫苗有长肽、RNA、DNA质粒、病毒载体、工程菌和抗原负载DCs。最近报道的完全个人化的临床试验使用了与突变序列相对应的多肽混合物(长度为15～30个氨基酸)，或具有内在佐剂活性并编码多个预测新表位链的mRNA，从开始处理患者的突变到疫苗给药，为3～4个月。在生产出个体化疫苗之前，患者一直接受其他标准或实验药物治疗，对于肽和mRNA疫苗平台，预期将减少到4周以下。

另一个挑战是确定最适合的疫苗接种临床环境。治疗性疫苗最有可能在佐剂或残留最小病灶中发挥特别好的作用，在这种情况下，肿瘤负荷低，免疫抑制机制尚未完全建立，控制较大的肿瘤负荷可能需要联合免疫疗法[18]。新表位疫苗可将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤，并在肿瘤微环境中介导PDL1的上调。因此，它可以将抗PD-1/PD-L1疗法的应用扩展。此外，新表位疫苗诱导的TH1+和CD8+T细胞可能通过促进强大的记忆反应来增强抗PD-1/PD-L1疗效的持久性。临床试验NCT0289765和NCT0328962旨在评估PD-1/PD-L1阻断联合新表位疫苗接种的效果，类似的CTLA4、LAG-3、TIM-3、IDO或TGF-β等抑制因子和共刺激分子(如OX40、GITR、CD137)的作用，以及T细胞竞争性细胞因子的添加，在临床前被证明对癌症疫苗增效。

5 个体化肿瘤疫苗的发展前景

肿瘤中的体细胞突变数量从几到几千不等，而且它们在很大程度上对每位患者都是独一无二的。肿瘤与宿主和环境因素(如HLA单倍型和其他遗传多态性、微生物群、年龄、其他疾病、免疫细胞库、肿瘤微环境的组成)之间存在微妙的相互作用，定义了免疫状态(“癌症免疫设定点”)，塑造了每个癌症个体[7]。个体化突变疫苗有望解决肿瘤异质性问题，这是传统抗癌治疗失败的原因。患者的疫苗成分可以针对不同的克隆，因为它能够针对一个肿瘤内的多个表位，并且可以根据肿瘤的变化进行调整。

个性化的癌症疫苗的挑战包括确定最合适的临床背景、缩短生产周转时间、扩大生产规模和确保可负担性[19]。数字时代的新趋势和新技术将改进预测新表位的计算。通过TCR谱分析、高通量单细胞测序和循环肿瘤DNA检测，可以对肿瘤、微环境和免疫进行更高分辨率的分析。从转录组数据分析出肿瘤细胞的表型和功能状态可以支持联合治疗的选择。突变是致癌过程和治疗失败的关键启动点，是所有癌症的共同点，因此一种个性化的突变疫苗有可能成为一种治疗癌症普遍适用的方法。