代谢组学在干眼研究中的应用进展△

金 拓 高卫萍

干眼是由于泪液的质或量以及动力学异常导致的泪膜不稳定或眼表微环境失衡所致的慢性眼病，可伴有眼表炎症反应、组织损伤及神经异常等病理改变，造成患者眼部多种不适症状和(或)视功能障碍[1]。近年来，干眼在世界范围内的发病率不断上升。调查显示，全球范围内干眼发病率为5.5%～33.7%[2]。干眼患者多表现为眼内异物感、眼部不适、干燥感、畏光、灼烧、疼痛和视物模糊等[3]。目前关于干眼的发病机制尚未完全清楚，这就需要新的研究方法更好地了解这种疾病的发病机制，从而促进其预防和治疗。代谢组学是现代组学在生物系统综合分析中新兴的一门学科，是一种对代谢产物进行鉴定和定量的组学技术，因其灵敏度和准确性高已被越来越多地应用于眼科研究中。借助代谢组学识别新的生物标志物和紊乱的代谢通路有助于更好地理解干眼的病理生理学，并可能指出新的治疗靶点。本文综述了代谢组学在干眼研究中的应用进展，并提出了未来研究的方向。

1 代谢组学概述

1.1 代谢组学的研究意义代谢产物作为生物反应和活动的中间体，在连接各种细胞通路和不同系统之间的通信中起着重要作用。代谢产物的水平取决于相应酶的含量、活性和性质，它们参与多种生化反应，涉及不同的调控过程，发挥不同的功能[4]。基因决定可能发生的事情，代谢产物则代表正在发生的事情[5]。因此，代谢产物的水平代表了细胞或组织对遗传或环境变化所产生反应的表型的综合信息，是生物体内部活动(基因表达、蛋白质活性、细胞代谢)和外部因素(如饮食、健康状况、生活方式、肠道微生物、药物等)相互作用的结果[6]。由于代谢组学检测的是基因表达的最终产物，所鉴定的代谢产物和代谢途径比许多其他组学技术更接近表型，所以它被认为是一种更敏感的测量生物表型的方法[7]。因此，代谢组学研究现已越来越多地被应用于诊断疾病以及发现生物标志物。代谢组学可以在生物体整个器官、组织和体液中开展研究，无论是在体外还是在体内均可进行，代谢组学研究常见的生物样本包括肝脏、肿瘤、脑、脂肪、尿液、血清、血浆、唾液、眼泪、胰液、肠液等[8]。

1.2 代谢组学的分类及主要分析技术一个典型的代谢组学研究工作流程包括：研究设计、样本收集和制备、仪器分析、数据处理和统计分析。代谢组学可分为靶向性代谢组学和非靶向性代谢组学，靶向性代谢组学分析的主要是特定的代谢产物，非靶向性代谢组学范围宽泛，目标是从生物样本中同时分析尽可能多的代谢产物[9]，两者目的有所区别，设计研究时应根据实验目的选择相应的方式。

目前代谢组学采用的主要分析技术有核磁共振波谱和质谱[10]两种。核磁共振波谱法主要检测可溶性代谢产物，不破坏样品，可以对体内样品进行无创、长时间的重复分析。与质谱相比波谱的敏感性和代谢产物分辨率较低。质谱更灵敏，可以覆盖更广泛的代谢产物，但会破坏分析样品。质谱技术为了进一步提高灵敏度，通常联用不同的分离技术，常用的如气相色谱质谱联用(GC-MS)[11]、液相色谱质谱联用(LC-MS)[12]和毛细管电泳质谱联用(CE-MS)[13]。GC-MS是代谢组学中广泛使用的分析技术[14]，GC-MS灵敏度高、峰分辨率高、重现性好[15]。但是，GC-MS只能用于分离和鉴定相对分子质量较低以及挥发性的代谢产物，为了检测具有极性、热稳定性差、非挥发性的代谢产物，在分析之前需要对样品进行化学衍生化[16]。与GC-MS相比，LC-MS不需要对样品进行衍生化预处理，可分析热稳定性差、非挥发性、不易衍生化及相对分子质量较大的代谢产物[17-18]。正因为具有这些优点，LC-MS是目前代谢组学中应用最广泛的技术[19]。其缺点是分离效率低，耗时较长。CE-MS是代谢组学中较为成熟的分析技术，特别适合对极性和带电代谢产物的分析[13]，分离效率比LC-MS和GC-MS更高，但是由于其重复性低，在代谢组学研究中往往不受青睐[20]，使用较少。不同的联用技术各有优缺点，因此，为了测量不同类别的代谢产物，增加代谢组覆盖率，需要同时使用不同的分离方法[21]。

2 代谢组学在干眼研究中的应用

干眼的病因复杂，通常是由多种因素引起的，包括睑板腺功能障碍、老化、泪腺功能障碍、性激素水平变化以及不良的外部环境等。大多数患者经过治疗，症状和体征可能会得到改善，但并不能完全治愈[22]。2017年，国际泪膜和眼表学会干眼病工作组第二次会议发布了一份报告，将干眼分为两大类:水液缺乏型干眼和蒸发过强型干眼，前者本身又可根据有无干燥综合征(SS)分为两个子类:即SS型干眼和非SS型干眼[23]。SS是一种慢性自身免疫性疾病，可分为原发性和继发性两种，其特征是唾液腺和泪腺内单核细胞浸润，导致组织破坏引发严重干眼[24]。

代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后迅速发展起来的生化研究领域，其主要研究内容包括鉴定和量化生物样本在特定条件或疾病下的所有代谢产物或特定代谢产物，并识别相关的代谢途径和基因[25]。代谢物作为体内代谢过程中的产物或底物，受到基因、环境和日常饮食习惯的共同影响，参与机体内稳态维护，可作为生物标志物，指示正常的生物过程、致病过程或对治疗干预的药理反应[26]。目前，代谢组学在干眼方面的研究主要集中于对血液、泪液、唾液、细胞及尿液等样本的分析。

2.1 血液标志物与干眼Vehof等[27]采用基于气相和液相色谱结合质谱技术对2819名受试者血清样本进行非靶向代谢组学分析，测试了222种已知血清代谢产物与干眼之间的相关性。结果显示，雄激素水平降低与干眼，特别是症状之间存在高度的相关性，雄激素可以作为干眼的生物标志物。Fernández-Ochoa等[28]采用基于高效液相-电喷雾-四级杆飞行时间串联质谱的代谢组学方法对从SS患者和健康志愿者采集的血浆样本进行分析。他们发现，在健康志愿者和SS患者的血浆中有31个代谢产物存在显著性差异，其中12个血浆代谢产物可以被注释。这些发现有助于对SS发病机制的探索。Osae等[29]通过代谢组学技术分析了高脂肪饮食组小鼠和正常饮食组小鼠血浆中的胆固醇酯、甘油三酯、神经酰胺和神经鞘磷脂代谢变化。结果显示，与正常饮食组小鼠相比，高脂肪饮食组小鼠血浆中胆固醇酯、甘油三酯、神经酰胺和神经鞘磷脂水平更高，并且高脂肪饮食组小鼠睑板腺出现肥大，说明高脂肪饮食不仅会导致血脂异常，还会改变睑板腺结构和功能。这些发现提示饮食控制是睑板腺功能障碍所致干眼治疗策略中值得考虑的一个重要因素。

2.2 泪液标志物与干眼Chen等[30]利用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间二级质谱技术对18例干眼患者和19名正常人的泪液样本进行了代谢产物谱分析，共鉴定出156种代谢产物，其中有34种代谢产物在干眼患者泪液与正常人泪液显示出明显差异。这其中有很多代谢产物被报道具有抗炎活性和保护作用，包括3-羟基-2-氨基苯甲酸、焦谷氨酸、尿刊酸、尿苷、肉碱、肌苷、精氨酸和黄嘌呤。这些代谢产物有可能成为干眼潜在的诊断性生物标志物，有助于提高对干眼诊断的准确性。Jiang等[31]采集干眼患者及正常人泪液样本，使用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间二级质谱技术对代谢产物进行定量分析，发现20个候选标志物中有4个与眼表疾病指数评分显著相关，57个候选标志物中有42个与泪膜破裂时间显著相关，26个与荧光素染色评分显著相关。从这三组的重叠部分来看，51种代谢产物中有48种促进干眼的发生，不同年龄组代谢产物有明显的变化。代谢途径分析表明，其主要途径为葡萄糖代谢、氨基酸代谢和谷胱甘肽代谢。这项研究显示了干眼患者和非干眼患者以及不同年龄组之间存在不同的代谢组学特征，部分阐明了代谢产物变化、干眼症状和年龄之间的关系。Pieragostino等[32]使用LC-MS技术分析了14例女性干眼患者和13名健康女性的泪液样本，结果显示，与健康人群相比，干眼患者的泪液样本中皮质醇、雄烯二酮和17α-羟基孕酮含量显著降低。性激素失衡是导致干眼的一项重要原因，性激素水平变化通常会改变泪液代谢，通过鉴别泪液中类固醇水平可对干眼的诊断提供帮助。

2.3 唾液标志物与干眼Kageyama等[33]用GC-MS技术分析了原发性SS患者及健康人的唾液样本。他们共检测到88种代谢产物，其中41种在原发性SS患者样本中含量降低。此研究结果表明，代谢组学能发现唾液中的生物标志物，这些标志物可以作为原发性SS的诊断工具或作为探索该疾病潜在发病机制的研究工具。Herrala等[34]对原发性SS患者及健康人唾液样本进行了质子核磁共振波谱分析，发现原发性SS患者唾液样本中胆碱在各时间点、牛磺酸在最后三个时间点、丙氨酸在最后两个时间点以及甘氨酸在最后一个时间点浓度均显著升高。代谢产物输出分析结果显示，胆碱在患者体内变异最低。尽管个体内和个体间存在相当大的差异，但原发性SS患者的特定代谢产物水平与健康人不同，这可能会成为监测治疗反应的新的标志物。原发性SS的早期诊断和治疗可以有效防止腺体和器官的不可逆性损伤，特异度和灵敏度更高的诊断方法无疑会使原发性SS患者更加受益[35]。

2.4 细胞标志物与干眼Chen等[36]采用了正常人结膜细胞系IOBA-NHC细胞作为模型，研究高渗透压引起的代谢产物变化。通过整体代谢组学分析发现，高渗透压下IOBA-NHC细胞中甘油磷酰胆碱水平呈剂量依赖性增加。这一趋势通过靶向代谢组学分析得到了证实，表明甘油磷酰胆碱是优于其他内源性代谢产物的首选渗透保护剂。并且还首次发现甘油磷酰胆碱合成和氧-乙酰氨基葡萄糖糖基化是高渗透压下眼表层细胞的关键激活途径。这些发现扩展了目前人们对干眼代谢物标志物方面的认知，并为其提供了潜在的治疗靶点。Wang等[37]对应激人角膜上皮细胞进行了代谢组学研究，跟踪了135种代谢产物。使用催泪蛋白处理样品10 min后有29种代谢产物含量发生改变，细胞中氧化磷酸化增强(谷氨酸和谷氨酰胺下降)、蛋白质聚集减少(炔诺酮减少)。其机制与快速促进自噬通量、迅速恢复细胞代谢和线粒体融合有关，表明外源性催泪蛋白能恢复干眼患者泪液的稳态，这为干眼的治疗提供了新的方案。

2.5 尿液标志物与干眼Lee等[38]使用核磁共振氢谱分析测定干眼模型组及正常对照组大鼠尿液中的内源性代谢产物。使用主成分分析和正交偏最小二乘判别分析对全局剖析中的核磁共振波谱进行模式识别，发现干眼模型组和正常对照组代谢产物之间存在不同的簇。并发现尿液样本中苯丙氨酸、苯乙酸、泛酸、甘氨酸、琥珀酸、甲醇、缬氨酸、丙二醇、组氨酸、苏氨酸、乳酸、乙酸在干眼模型组和正常对照组大鼠之间有显著差异。这些结果可能有助于人们理解干眼所涉及的代谢调节，并有助于寻找与干眼相关的潜在标志物，提高干眼临床诊断的准确性。

3 总结

代谢组学作为研究机体代谢产物变化的一种新方法，能帮助人们更好、更深入地了解生物系统对环境和基因变化的响应，在揭示复杂性疾病的机制方面具有独特的优势。近年来，代谢组学的研究呈现突飞猛进的发展势头。虽然眼睛在理论上是代谢组学研究的合适对象，但是由于眼部组织及液体不容易获得，所以代谢组学在眼科学研究中仍处于探索阶段，其中对于干眼的研究更是十分有限。目前应用于干眼研究的代谢组学数据大部分来自少量的临床样本，相关的动物实验也开展的较少。代谢组学对于干眼诊断、机制研究以及潜在药物开发方面的巨大潜力并未被完全发掘，未来需要在大样本、多中心、盲性和随机化的条件下开展更进一步的研究。