河北邢台及周边地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查

王福厚，李风云，葛生虎

（1.甘肃畜牧工程职业技术学院，甘肃 武威 733006；2.临西县农业农村局，河北 邢台 054900；3.河北铭诸生物科技有限公司，河北 邢台 054000）

猪圆环病毒2型（PCV2）为已知最小DNA病毒，属于圆环病毒科、圆环病毒属重要成员。PCV2在全世界广泛分布，该病原感染可引起断奶仔猪多系统综合征、猪圆环病毒相关疾病及母猪繁殖障碍等，严重危害我国养猪业健康发展[1]。此外，PCV2感染可引起病猪出现免疫抑制，导致其容易继发感染其它病原，从而造成更加严重的临床症状和病死率[2]。

PCV2基因组大小为1 766～1 768 nt，其主要包含2个开放阅读框（ORFs），其中ORF2基因可编码Cap蛋白，参与病毒入侵宿主细胞和诱导机体产生中和抗体等[3]。此外，ORF2是PCV2基因组中变异程度最高的基因，根据PCV2 ORF2基因序列特征，国内外流行的PCV2毒株可分为8个基因亚型（PCV2a-PCV2h）[4]。严世杰等调查发现2015—2019年河北秦皇岛及周边地区PCV2流行毒株主要为PCV2b和PCV2d，其中也有少量PCV2e流行[1]；赵云环等调查发现河北部分地区存在3种不同PCV2基因亚型（PCV2a、PCV2b和PCV2d）[5]。为初步了解河北省邢台市及周边地区PCV2流行情况，研究于2021年10月至2022年6月共采集疑似感染PCV2病料样品205份，调查PCV2分子流行病学特点；同时扩增并分析部分PCV2阳性样品ORF2基因序列，旨在为该地区PCV2的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2021年10月至2022年6月从河北省邢台市及周边地区的79个猪场采集疑似感染PCV2病猪临床样品（组织或血清样品等）共205份。

对于组织样品的采集：猪场工作人员解剖病猪后，无菌采集淋巴结、肺脏、扁桃体和肾脏等组织样品置于洁净封口袋内，标记相关信息后低温送至河北铭诸生物科技有限公司。对于血清样品的采集：猪场工作人员通过颈静脉或前腔静脉采集猪只静脉血3～5 mL/头；待血清析出后，取血清样品置于1.5 mL离心管中，标记相关信息后低温送至河北铭诸生物科技有限公司。

1.2 样品处理及PCV2核酸检测

用无菌手术刀切取少量组织样品，切碎后加入灭菌PBS溶液后充分研磨，反复冻融后低温高速离心。取200 μL上清液（或血清）用于DNA基因组提取，提取步骤严格按照试剂盒（于武汉科前生物股份有限公司购买）说明书进行，最后用40 μL无核酸水洗脱DNA基因组，保存于-20℃，待检。

采用商业化荧光定量PCR试剂盒（湖南冠牧生物科技有限公司产品）检测待检组织样品中是否存在PCV2核酸，操作步骤严格按照试剂盒提供说明书进行。每次检测试验中均设置阴性对照和阳性对照各2个，其中阴性对照和阳性对照核酸分别为无核酸水和已知PCV2核酸。反应结束后，若样品对应CT值低于35，则判定为阳性；若CT值高于40，则判定为阴性；若CT值为35～40，则为可疑。

1.3 PCV2 ORF2基因序列扩增与分析

取10份PCV2核酸阳性且CT值低于25的样品用于ORF2基因序列扩增。根据参考文献[6]设计并合成扩增PCV2 ORF2基因序列引物，PCR扩增体系（25.0 μL）包括2×PCR预混液12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA基因组模板2.0 μL及无核酸水9.0 μL；反应条件为95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃30 s，72 ℃ 45 s，共设置35个循环；最后72 ℃7 min。反应结束后取少量PCR产物进行琼脂凝胶电泳，其后将阳性样品送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

于GenBank数据库中下载不同基因型PCV2毒株（PCV2a-PCV2f）ORF2基因序列，采用DNASTAR软件分析本文获得序列与参考毒株ORF2核苷酸和氨基酸序列同源性；采用MEGA 7.0软件构建系统进化树，初步分析本文获得PCV2毒株基因亚型。

2 调查结果

2.1 河北省部分地区PCV2分子流行病学调查结果

本研究于2021年10月至2022年6月从河北邢台及周边地区79个猪场采集疑似感染PCV2病料共205份，采用分子生物学技术检测样品中PCV2分子流行病学特征。结果如表1所示，共41个猪场中含有PCV2核酸阳性猪，场阳性率为51.90%（41/79）；67份样品为PCV2核酸阳性，平均检出率为32.68%；进一步按区域划分，可见不同地区PCV2场阳性率为22.22%～63.64%，样品阳性率为20.83%～43.33%，其中石家庄来源样品PCV2检出率相较其它地区更低。

表1 河北省部分地区PCV2分子流行病学调查结果

2.2 不同类型猪场及临床症状样品PCV2分子流行病学调查结果

将送检样品按照猪场类型（小型猪场、中型猪场和集约化猪场）进行区分，如表2所示，可见小型猪场PCV2场阳性率较中型猪场和集约化猪场高，分别为100.0%（8/8）、58.33%（14/24）和40.43%（19/47）；小型猪场、中型猪场和集约化猪场来源样品PCV2检出率分别为61.90%（13/21）、42.67%（32/75）和20.18%（22/109）。PCV2感染可引起仔猪出现皮炎肾病综合征、繁殖母猪流产、死胎等临床症状，进一步统计分析可见表现皮炎肾病综合征仔猪、繁殖障碍母猪和其它症状猪群组织样品PCV2检出率分别为45.45%（30/66）、51.85%（14/27）和20.54%（23/112）。

表2 不同类型猪场及临床症状样品PCV2分子流行病学调查结果

2.3 PCV2 ORF2基因序列分析结果

采用PCR法扩增10份PCV2阳性样品ORF2基因序列并测序与分析，结果发现10份PCV2阳性样品ORF2基因核苷酸序列长度均为705 nt，其编码Cap蛋白氨基酸序列长度为235 aa；序列分析结果表明，10份样品ORF2基因核苷酸和对应氨基酸序列同源性分别为96.4%～100.0%和98.7%～100.0%，其中6份样品与已知PCV2d毒株ORF2基因序列同源性最高；4份样品与已知PCV2b毒株ORF2基因序列同源性最高。进一步系统进化分析发现，6份样品与PCV2d参考株聚为同一分支，4份样品则与PCV2b参考株同属一个分支。

3 讨论

PCV2在我国流行情况十分严重，同时由PCV2感染引起的猪圆环病毒相关疾病对我国养猪业的健康发展造成了巨大的威胁。此外，PCV2感染可引起生猪出现免疫抑制，如淋巴系统损失和免疫缺陷等，导致病猪更容易感染其它病原，从而造成多种病原混合感染或继发感染，导致疾病诊断与防控更加困难。PCV2具有多种基因型，且不同地区流行PCV2基因型种类和比例具有很大差异，如2019—2020年北京市部分地区流行PCV2毒株包括PCV2a、PCV2b和PCV2d，所占比例分别为33.33%（3/9）、55.56%（5/9）和11.11%（1/9）[7]；安徽地区流行PCV2毒株则主要为PCV2b和PCV2d，所占比例分别为36.36%（8/22）和63.64%（14/22）[8]。因此，了解PCV2流行情况和基因型特征对该病的防控十分重要。

为防控非洲猪瘟的流行，诸多猪场已提高生物安全水平，这同时也抑制了其它传染病的流行。尽管如此，本研究结果发现河北省部分地区PCV2猪场阳性率和样品阳性率分别为51.90%和32.68%，其中衡水市PCV2场阳性率和样品阳性率分别高达58.82%和43.33%，虽然本研究所调查猪场和样品数量偏少，但其结果仍可提示目前PCV2广泛流行于被调查地区。进一步分析发现小型猪场无论是PCV2场阳性率还是样品阳性率均高于中型猪场和集约化猪场，这可能是由于中型猪场和集约化猪场更加重视科学免疫、定期抗体和抗原监测、提高猪场生物安全管理水平等，而大部分小型猪场可能会忽视这些，使得小型猪场猪群感染病原几率更高，特别是这些容易出现隐性感染的病原，如PCV2和猪繁殖与呼吸综合征病毒[9]。此外，我们还发现未表现PCV2相关疾病症状猪群病原检出率也较高，为20.54%（23/112），说明PCV2在猪群的隐性感染情况十分严重，同时也提示猪场对PCV2的抗原监测十分重要。

为确定河北省部分地区流行PCV2毒株的基因型，我们对10份PCV2阳性样品ORF2基因序列进行扩增、测序和分析。结果发现，获得的10份PCV2阳性样品中仅检出有PCV2b和PCV2d，其所占比例分别为40%和60%，提示PCV2b和PCV2d是河北省部分地区流行主要基因型。但其它学者研究中发现河北省还存在PCV2a和PCV2e基因型流行[1，5]，这可能与本文获得序列样品太少等有关，因此后续研究中将持续关注PCV2分子流行病学和基因型分布特征，为该病的防治提供依据。