2020—2021年河北邢台及周边地区猪瘟流行病学调查与分析

王福厚，葛生虎

（1.甘肃畜牧工程职业技术学院，甘肃 武威 733006；2.河北铭诸生物科技有限公司，河北 邢台 054000）

猪瘟（CSF）又称为“猪霍乱”，是由猪瘟病毒（CSFV）感染所引起的一种高致死性传染病[1]。CSFV的易感动物主要是家猪和野猪，猪群感染CSF后主要临床症状包括高热、精神沉郁、多器官出血等，且病死率高。目前该病是影响我国养猪业健康发展的主要传染性疾病之一，同时也是猪场优先净化的病种[2]。

CSFV属于单链RNA病毒，为黄病毒科重要成员，该病毒基因组约12.3 kb，主要包含1个大的开放阅读框（ORF），编码多聚蛋白；多聚蛋白可进一步水解为4种结构蛋白和8种非结构蛋白，其中结构蛋白为C、E0、E1和E2；非结构蛋白则为Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B[3]。根据NS5B或E2部分核苷酸序列差异，可将全世界流行的CSFV毒株分为3个基因型（1、2和3）共11个基因亚型（1.1～1.4、2.1～2.3、3.3～3.4）；其中2.1基因亚型可进一步分为2.1a、2.1b、2.1c和2.1d[4]。目前我国流行的CSFV毒株主要是2.1亚型，20世纪90年代以来国内流行CSFV毒株以2.1b亚型为主，但近年来国内部分地区也出现了2.1c或2.1d亚型[4]。

国内猪场防控猪瘟主要依赖于接种猪瘟兔化弱毒疫苗或E2亚单位疫苗，其效果较好，但猪瘟在我国猪场尚未根除，各地仍零星暴发疫情，严重危害当地养猪业的发展。为初步了解近年来河北省猪瘟流行情况，笔者从河北邢台及周边地区猪场采集血清及组织样品分别检测CSFV抗体和核酸，同时分析部分阳性样品CSFV基因型，旨在为该病的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

于2020年1月至2021年12月从河北邢台、保定、邯郸、秦皇岛、张家口和石家庄等地区猪场采集血液样品和疑似感染CSF组织样品分别为1 644份和306份。将血液样品保存于凝血管内，将组织样品装入洁净封口袋内，低温送至河北铭诸生物科技有限公司，待检。

1.2 血清样品处理及CSFV抗体检测

将凝血管中血清吸出至1.5 mL离心管内，其后低速（3 000 r/min）离心10 min，取上清液置于新的离心管内，标记相关信息后保存于-20 ℃，待检。

使用猪瘟病毒（CSFV）ELISA抗体检测试剂盒（韩国金诺产品）检测血清中是否存在CSFV抗体，每次检测均设置2个阳性对照和2个阴性对照，作为质控组。ELISA检测步骤和结果判定均严格按照试剂盒提供说明书进行。

1.3 组织样品处理及CSFV核酸检测

在超净工作台上取出组织样品，用灭菌手术刀切取少量组织样品入研钵内，剪碎后加入少许生理盐水，充分研磨。取200 μL上清液用于病毒DNA/RNA基因组提取（试剂盒购自于武汉科前生物股份有限公司），基因组提取步骤严格按照试剂盒提供说明书进行。

使用猪瘟病毒通用荧光定量RT-PCR试剂盒（湖南冠牧生物科技有限公司产品）检测核酸样品是否存在CSFV核酸。每次检测均设置阳性和阴性对照，操作步骤和结果判定严格参考试剂盒说明书进行。

1.4 CSFV阳性样品E2基因序列RT-PCR扩增、测序及分析

参考Yao等发表文章[4]中扩增CSFV毒株E2基因序列所用引物，将引物送至生工生物工程（上海）有限公司合成。取4份CSFV阳性且CT值均低于22的RNA样品，用于CSFV E2基因序列RT-PCR扩增，其PCR体系与反应条件与参考文献[4]均一致。RT-PCR反应结束后取少许产物用于琼脂糖凝胶电泳，观察结果后将剩余阳性RT-PCR产物送至生工生物工程（上海）有限公司进行双向测序。

在GenBank数据可中下载不同基因型CSFV毒株E2基因核苷酸序列，采用DNAstar软件分析本试验获得的CSFV E2基因序列与不同基因型参考毒株对应序列的同源性，以此初步分析本文获得毒株的基因型及遗传变异情况。

2 结果

2.1 血清CSFV抗体检测结果

调查结果如表1所示，本试验共采集血清样品1 644份，共1 330份血清检测为CSFV抗体阳性，平均阳性率为80.90%。进一步分析可知，2020年收集血清样品CSFV抗体阳性率（76.33%）较2021年（85.13%）低；散养户、中小型规模猪场和大型规模化猪场送检样品CSFV抗体阳性率分别为72.13%（264/366）、77.39%（534/690）和90.48%（532/588）。

表1 不同年份及不同养殖模式猪场血清CSFV抗体检测结果

2.2 组织样品CSFV核酸检测结果

本试验共收集306份疑似感染CSF猪的组织样品，用于检测CSFV核酸阳性率，结果发现，共45份组织样品为CSFV核酸阳性，平均检出率为14.71%；其中2020年和2021年收集样品CSFV检出率分别为18.69%（20/107）和12.56%（25/199）。此外，该病在一年四季均可发生，其中春季、夏季、秋季和冬季送检样品CSFV核酸检出率分别为11.29%（7/62）、14.89%（14/94）、12.50%（10/80）和20.00%（14/70）。详见表2。

表2 不同年份及季节组织样品CSFV核酸检测结果

2.3 CSFV毒株E2基因RT-PCR产物凝胶电泳结果

采用RT-PCR法检测4份不同地区且CT相对较低CSFV阳性样品的E2基因序列，并将RT-PCR产物进行凝胶电泳。如图1所示，4份样品均扩增出约1 500 bp大小条带，与预期片段大小一致，且阳性对照和阴性对照均成立。说明成功扩增出4份阳性样品E2基因序列。

2.4 序列分析结果

4份样品E2基因核苷酸序列长度一致，为1 491 bp，进一步的核苷酸序列同源性分析结果发现（图2），4个样品之间E2基因核苷酸序列均与GenBank收录的猪瘟病毒2.1d亚型毒株同源性最高，为99.7%～99.8%，而与其它亚型毒株同源性相对较低。以上结果说明本试验获得的4个CSFV毒株均为2.1d亚型。

图2 本试验获得4个阳性样品E2基因核苷酸序列同源性对比结果

3 讨论

近年来，非洲猪瘟在我国广泛流行，为有效防控该病，养殖企业（户）采取系列措施提高猪场生物安全水平，同时也积极开展传染病净化工作，其中包括伪狂犬病和CSF的净化。尽管如此，CSFV仍然在我国部分地区流行，且近年来笔者在河北地区接触到许多猪场暴发CSF的案例。为初步评估CSF在河北省流行情况，本研究从河北邢台及周边地区采集血清及组织样品分别检测CSF抗体和病原情况，以评估猪场CSF疫苗免疫效果和CSFV分子流行情况。结果发现，被调查地区猪场血清CSF抗体阳性率为80.90%，已达到农业农村部规定的70%以上水平，其中2020年和2021年采集抗体阳性率分别为76.33%和85.13%，说明养殖企业（户）逐渐开始重视了CSF的疫苗免疫工作。尽管如此，本研究结果仍然低于张利平等（河南地区猪场）[5]和任昊（山西长子县）[6]调查结果，张利平等[5]和任昊的调查结果分别为91.03%（639/702）和84.12%（3 719/4 421），这可能与采集样品猪场类型、样品数量和生猪生长阶段等因素有关。

分子流行病学调查结果表明，被检测的306份组织样品中CSFV抗原检出率为14.71%，且各被调查地区均有CSFV阳性猪场，说明该病原目前广泛流行于河北各地区。此外，本研究结果低于张卫兵调查山西地区结果[18.0%（45/250）][7]，但该地区猪群CSFV抗体阳性率超过85%，提示CSF的防控不能仅仅依赖于疫苗免疫，提高猪场生物安全水平也是十分必要的。进一步分析发现2021年采集组织样品CSFV抗原阳性率低于2020年，说明近年来猪场已开始重视CSF的防控工作；但该病原在四季均可检出，说明该病的发生无明显的季节性，企业需持续关注CSF的防控与净化工作。

为进一步分析河北省CSFV流行毒株的基因型，笔者采用RT-PCR法扩增并分析了4份阳性样品E2基因序列。结果发现4份阳性样品E2基因核苷酸序列已知CSFV 2.1d亚型毒株对应序列同源性最高，说明4个CSFV流行毒株均为2.1d亚型。由于本研究获得毒株序列较少，仅能说明2.1d亚型CSFV毒株流行于河北省部分地区，但该毒株是否为主要基因型，或是否有其它基因亚型毒株也流行于河北省，还需要进一步调查。