LC/Q-TOF鉴定蚝油中非挥发性特征物质的研究

TIN Hoe-seng

(华南师范大学 化学与环境学院，广州 510631)

牡蛎又名蚝、蛎黄、海蛎子，属软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(Lamellibranchia)、异柱目(Anisomyaria)、牡蛎科(Ostreinae)，是世界上重大的养殖贝类，同时也是我国养殖产量很大的经济贝类，尤其在广东、广西、福建、浙江、台湾等沿海地区资源非常丰富[1]。《2020中国渔业统计年鉴》数据显示[2]，2019年中国牡蛎海水养殖产量达到522.56万吨，相比2018年的513.98万吨增长1.7%。中国牡蛎的主要产地集中在福建和广东等地，福建牡蛎养殖历史悠久，迄今已成为中国较大的牡蛎养殖区。2019年福建省牡蛎海水养殖产量达到201万吨，位居全国前列，其次是广东省114万吨。牡蛎不仅含有丰富的营养物质，如蛋白质(包括8种人体必需氨基酸)、糖原、维生素及锌、硒、铁、铜、碘等微量元素，而且具有增强机体免疫力等多种保健功能[3-4]。此外，牡蛎肉细嫩、味鲜美，具有良好的食品加工价值，其中蚝油是牡蛎精深加工的主要产品之一。

蚝油是一种利用牡蛎蒸煮后的汁液(即蚝汁)进行浓缩或直接酶解牡蛎肉，再加入糖、食盐、淀粉或改性淀粉等原料，辅以其他配料和食品添加剂制成的调味品[5]。其成品鲜亮有光泽、蚝香浓郁、滋味鲜美、入口滑润、营养价值高，深受广东、福建、港澳台及东南亚地区消费者的喜爱，在内陆地区的市场销售份额也逐渐扩大[6-7]。

蚝油等水产调味品的滋味主要包括鲜、甜、咸、苦、酸等。其中鲜味也是水产品的特征风味之一，主要的鲜味物质有鲜味氨基酸(如谷氨酸)[8]、呈味核苷酸(如IMP和GMP等)、呈味肽、乳酸、琥珀酸等[9-10]。还有许多协同增鲜物，如丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸及一些无机物等。呈味肽一般是指对食品风味有一定贡献的寡肽类物质，是从食物中提取或由氨基酸合成，包括特征滋味肽和风味前体肽[11]。呈味肽具有多种滋味特征，其呈味效果往往不是单一的某种滋味，而是各种滋味的综合效应，从而赋予食品鲜美浓郁、圆润香滑、回味悠长的味感，能够通过协同作用呈现出一定的鲜味特征[12]，为食品增添风味，同时还能提供肽及氨基酸类营养成分[13]，是蚝油极为关键的风味物质。

许凌志[14]利用模糊技术评价发酵蚝油，但该研究只纳入了脂肪、蛋白质及氨基酸总量为关键指标组分，不足以精准衡量其中的关键物质。王丰[15]针对不同加工工艺对浓缩蚝汁风味的影响进行研究，并利用氨基酸分布及感官鉴评对不同加工工艺的蚝汁进行评价，并未对除了氨基酸之外的组分进行研究。然而，目前针对牡蛎或蚝油中非挥发性风味物质的研究较少，尤其是蚝油呈味肽信息更是稀缺[16-17]。

本研究选择不同品牌的蚝油，研究非挥发性风味物质含量的差异性，采用溶剂溶解-离心分离的方法进行前处理，样品上清液经滤膜过滤后直接使用液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪进行分析，在较宽的质量范围内，对蚝油中的非挥发性物质实现分离和鉴别；通过数理统计软件筛选可能的备选物，再通过二级质谱的目标物碎片扫描，结合谱库检索，推测出目标物的结构。该研究结果以期能够为蚝油产品风味质量的精准控制提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

蚝油：购于线下超市以及线上电商；色谱纯甲醇、色谱纯乙腈、分析纯甲酸：美国赛默飞世尔公司。

Agilent 6545B LC/Q-TOF MS四极杆飞行时间液质联用系统、离子源类型ESI； Eppendorf 5804R低温高速冷冻离心机；Milli-Q Synergy Water Purification System超纯水机。

1.2 方法

称取5.0 g蚝油待测样品于离心管中，然后向离心管中加入5.0 mL甲醇(色谱纯)溶液，采用涡旋混合器充分混合均匀，静置10 min后，以10000 r/min离心15 min，取上清液过0.22 μm的有机相滤膜，最后将上清液直接进行进样分析。

液相色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD色谱柱(2.1 mm×150 mm，1.8 μm)。

流动相：含0.1%甲酸的高纯水(溶剂A)、乙腈(溶剂B)。流速为0.30 mL/min，进样体积为5.0 μL，洗脱方式见表1。

表1 流动相洗脱方式Table 1 Mobile phase elution method

柱温箱温度30 ℃，自动进样器温度25 ℃，正离子模式扫描。干燥气温度为325 ℃，干燥气流速为10 L/min，鞘气(N2)温度为350 ℃，鞘气流速为11 L/min，雾化气压力为10 psi，毛细管电压为4000 V。采样模式全扫描，质荷比范围50～1500 m/z。

1.3 数据处理

使用MassHunter Profinder软件处理LC/MS一级质谱数据：通常使用批量递归特征提取的方式提取化合物，选择Batch Recursive Feature Extraction (small molecules/peptides)，依次设定保留时间、质量数范围(250～1000 Da)、基线特征、加和离子类型和模式、同位素类型、化合物电荷数量等诸多参数，运行批处理后，得到提取出的化合物列表(未对化合物进行结构鉴定)，且包含化合物对应的色谱图和质谱图。最后将生成的化合物列表导出为cef文件，供MPP软件进一步分析。

使用Mass Profiler Professional软件进行数据分析：将ProFinder软件导出的cef数据文件导入MPP软件，对数据进行筛选、排序，完成数据分组和过滤，对化合物响应值进行归一化处理，选择合适的响应基线，完成数据导入。之后软件将自动创建一个显著性分析的工作流程，用于创建在组间有显著性差异的化合物。按显著性分析的步骤流程，能够在不同来源、品牌的蚝油的众多挥发性化合物中，找出在组间响应值有显著性变化的化合物，并导出差异化合物列表。

二级质谱扫描：一级质谱扫描得到的共有的特征化合物并未进行谱库检索定性，需要进一步进行二级质谱扫描。针对在蚝汁/蚝油中存在组间显著性差异的共有化合物，将其保留时间、母离子质荷比、碰撞能量等参数导入液质Targeted MS/MS扫描方法中，对样品进行二级质谱数据的采集，采集的结果与代谢库和多肽库等相关数据库进行比对，对这些共有化合物进行定性。

2 结果与分析

将4种蚝油中的非挥发性化合物数据导入MPP软件，经显著性分析，4种蚝油中的共有特征化合物共计67种，占总数的23.1%，具体见图1。

图1 4种蚝油共有的特征化合物Fig.1 Common characteristic compounds in the four kinds of oyster sauce

对于通过一级质谱筛选出的特征化合物，采用UHPLC再次对样品进行分离，电喷雾解离后，在碰撞室内被轰击后，断裂成碎片离子，根据碎片离子质荷比的不同进一步分离，被检测器接收，最终形成MS/MS图谱。多肽断裂过程中，主要形成卫星离子、序列离子和中间碎片离子，其中a，b和c为多肽N末端离子，x，y和z为多肽C端离子，而同一系列内相邻的离子碎片之间质荷比的差值可以体现它们之间相差的氨基酸信息。由于多肽链中的酰胺键更易于断裂，使得b和y离子在二级质谱中出现的几率较大，因此可将二级质谱中的b和y离子碎片解出多肽链的氨基酸序列。

选择共有化合物中响应值较高的若干化合物，对其二级质谱进行解析，见图2。由图2可知，保留时间在17.4 min左右的化合物被鉴定为Glu-Cys。其基峰离子为加和物[M+NH4]+=268.097 Da，其分子离子峰M+=250.087 Da。其碎片离子中强度最高的为130.065 Da，推测是Glu残基；二者之差为120.097 Da，推测为Cys残基。

依照上述类似的解析方法，对较高响应值的共有化合物进行二级质谱的解析，见图3。由图3可知，保留时间在1.85 min左右的化合物被鉴定推测为Thr-Phe-Lys-Leu；保留时间在5.47 min左右的化合物被鉴定推测为Gly-Pro-Pro-Val；保留时间在14.57 min左右的化合物被鉴定推测为Arg-Ser-Thr-Thr；保留时间在32.19 min左右的化合物被鉴定推测为Cys-Trp-Ser。

图2 UHPLC-ESI-Q-TOF MS/MS鉴定蚝油中多肽的氨基酸序列(1)Fig.2 Amino acid sequence of the polypeptides in oyster sauce determined by UHPLC-ESI-Q-TOF MS/MS (1)

(a) Thr-Phe-Lys-Leu

(b) Gly-Pro-Pro-Val

(c) Arg- Ser-Thr-Thr

(d) Cys-Trp-Ser

4种蚝油中的非挥发性化合物数据经解析鉴定后，得到26种多肽类化合物(见表2)，其摩尔分子质量介于250～670 Da之间，具有2～5个碳原子的支链，在4种蚝油中相对含量有所差异。其中，Asp-Leu-Arg(Cpd11)，Thr-Phe-Lys-Leu(Cpd04)及Asp-Glu-Ile-Leu (Cpd42) 在蚝油1中的相对丰度达到了16.81%、10.78%、10.59%。在蚝油2中发现，Ile-Glu-Asp-Phe(Cpd41)及 Ser-Ile-Asn-Val(Cpd10)的相对丰度分别达到了19.64%及18.56%。寡肽Ile-Glu-Asp-Phe(Cpd41)及Asp-Glu-Ile-Leu (Cpd42)在蚝油3中也达到了19.99%及17.25%的水平。蚝油4中Thr-Phe-Lys-Leu(Cpd04)及Val-Pro-Gln-Val(Cpd32)分别达到了15.80%及13.04%的水平。这些寡肽主要来自于酶作用下的蛋白质酶解以及蒸煮过程中水解所形成的寡肽[18]。

将所有多肽数据导入MPP软件，经显著性分析，4种蚝油可以聚为两类，蚝油1、蚝油2和蚝油3明显较为接近，而蚝油4与前三者存在一定的差异(见图4)，进一步说明4种蚝油在加工工艺上有一定的差异。王丰讨论了4种加工工艺(原汁蚝油加工、复合蚝汁加工、酶法酿造蚝汁加工和复合蚝汁加工工艺改进)对浓缩蚝汁风味的影响，并得出不同加工工艺对蚝汁品质的影响相当显著，与本文得到的聚类结果相符。

研究表明，肽链长度在一定程度上影响着肽分子的呈味性能。呈味肽氨基酸骨架结构式氨基酸数量在3～9 u之间，取值在4～6 u之间鲜味最强[19]。在鲜味肽的呈味规律机理研究中发现，不论是来自于谷元粉[20]、大豆[21]或者豆酱[22]，其分子量均集中在100～5000 u之间，集中在<1000 u范围内，与本研究中所鉴定的肽分子质量一致。此外，鲜味肽的氨基酸组成直接影响着其呈味效果。据报道，鲜味肽序列中通常含有Glu和Asn酸性基团的1种或2种[23]，或是含有一定的亲水性氨基酸残基Tyr、Gly、Thr、Phe、Asp等[24]，且在碱性氨基酸和酸性氨基酸共同存在的情况下鲜味肽方可呈现出鲜味,与本文相符。

表2 4种蚝油中多肽特征化合物相对丰度Table 2 Relative abundance of polypeptide characteristic compounds in the four kinds of oyster sauce

续 表

图4 4种蚝油中多肽特征化合物聚类树状图Fig.4 Dendogram of polypeptide characteristic compounds in four kinds of oyster sauce

3 结论

应用MassHunter Profinder软件处理LC/MS一级质谱数据，并结合Mass Profiler Professional软件进行显著性分析，在不同的蚝汁和蚝油中成功找出组间响应值有显著性变化的化合物。利用二级质谱扫描，结果与代谢库和多肽库等相关数据库进行比对，对这些化合物进行定性分析，蚝油中的非挥发性化合物数据经解析鉴定后得到26种多肽类化合物。结果表明，研究建立的方法体系将多肽数据经显著性差异分析能够将蚝油进行聚类，明确蚝油中特征物质的差异性，可为蚝油风味质量控制研究提供一定的参考。