益肾化湿颗粒对抗Thy-1型肾炎大鼠肾组织中PCNA、Akt表达的影响

董王钰， 杨 锐， 张春江， 许晓刚， 陶 林,2， 杨晓萍*

(1.石河子大学医学院第一附属医院，新疆 石河子 832000；2.石河子大学医学院，新疆 石河子 832000)

系膜增生性肾小球肾炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN) 是全球最常见的肾小球肾炎类型之一[1]，其基本病理特征为肾小球系膜细胞增殖和/或系膜细胞外基质沉积增多[2]。有研究表明，随着系膜细胞增生程度的加重，蛋白尿、总胆固醇、甘油三脂可随之升高，并伴随血清白蛋白的降低[3]。因此，抑制系膜细胞增殖对改善MsPGN肾功能、延缓病程进展至关重要。既往研究表明，益肾化湿颗粒具有抑制氧化应激、炎症、细胞凋亡、增殖的作用[4-5]。因此，本研究通过建立不可逆性抗Thy-1型MsPGN大鼠模型，观察肾组织病理变化，检测血清肾功能相关指标以及肾组织中PCNA、Akt蛋白和mRNA表达，探索益肾化湿颗粒对MsPGN疾病的治疗作用及调控机制，并探讨其与增殖的关系。

1 材料

1.1 动物 SPF级雄性SD大鼠60只，体质量(200±20)g，6周龄，购自新疆医科大学动物实验中心，实验动物生产许可证号SCXK(新)2018-0002，实验动物使用许可证号SYXK(新)2018-0003。大鼠饲养屏障环境为温度(23±3)℃，相对湿度40%～70%，自由进食饮水。实验经石河子大学伦理委员会批准[2020院伦理实字(177)号(No.01)]。

1.2 试剂与药物 益肾化湿颗粒(批号20200503，10 g/袋)购自广州康臣药业有限公司，完全溶解于45 ℃生理盐水中，配制成500 mg/mL药液备用；缬沙坦分散片(批号20210112，80 mg/片)购自海南皇隆制药股份有限公司，研磨成粉后溶解于45 ℃生理盐水中，配制成2 mg/mL药液。兔抗大鼠Thy1多克隆抗体、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)(货号bs-6951R)、p-Akt (Thr308)(货号bs-2720R)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)(货号bs-2007R)抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；尿蛋白定量测试盒(批号C035-2-1)购自南京建成生物工程研究所有限公司；山羊抗兔IgG H&L (HRP)(货号ab205718)、山羊抗小鼠IgG H&L (HRP)(货号ab205719)购自英国Abcam公司；β-actin抗体(批号100166-MM10)购自北京义翘神州科技股份有限公司。

1.3 仪器 酶标仪、蛋白转膜仪(美国Bio-Rad公司)；显微镜(日本尼康公司)；高速冷冻离心机(美国赛默飞世尔科技公司)；微量分光光度计(杭州奥盛仪器有限公司)；电泳仪(北京六一生物科技有限公司)；凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)；实时定量PCR仪(美国ABI公司)。

2 方法

2.1 动物造模、分组与给药 大鼠适应性饲养1周后，随机分为5组，即空白组、模型组、缬沙坦组(8.5 mg/kg)及益肾化湿颗粒低、高剂量组(3.125、6.25 g/kg)，每组12只，均行左肾切除术，7 d后，除空白组外，其余4组大鼠均经尾静脉单次注射2 mg/kg Thy-1抗体，建立不可逆性MsPGN大鼠模型，空白组尾静脉单次注射等体积生理盐水。造模完成后，各给药组灌胃给予相应剂量药物，空白组和模型组灌胃给予等体积生理盐水，连续6周。

2.2 样本采集 于第7、42天灌胃结束后，随机各取6只大鼠，使用代谢鼠笼收集24 h尿液，4 ℃、1 500 r/min离心5 min，取上清液单独分装，保存于-80 ℃冰箱；于第8、43天，将大鼠固定于操作台，麻醉后开腹，经腹主动脉取血4 mL，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，取上清液(即血清)单独分装，保存于-80 ℃冰箱；大鼠取血完毕后处死，完整摘取右侧肾脏组织，一部分固定于4%多聚甲醛，另一部分液氮速冻后转移至-80 ℃冰箱保存。

2.3 24 h尿蛋白定量检测 采用尿蛋白定量测试盒检测24 h尿蛋白水平。

2.4 血清肌酐、尿素氮水平检测 使用全自动生化分析仪检测血清肌酐、尿素氮水平。

2.5 肾组织病理变化观察 取于第8、43天固定的肾组织样本，经乙醇脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，切成4 μm薄片，分别进行HE、Masson染色，显微镜下观察并拍照，并对病理病变进行肾小球系膜细胞及基质增生程度、肾间质纤维化程度分级进行量化评分[6-7]。

2.6 Western blot法检测大鼠肾组织PCNA、Akt、p-Akt蛋白表达 取适量于第43天冷冻保存的肾组织，裂解后提取总蛋白，经电泳、转膜后，使用脱脂牛奶封闭1 h，加入一抗PCNA(1∶500)、Akt(1∶500)、p-Akt (Thr308)(1∶500)、β-actin(1∶1 000)4 ℃孵育16 h，洗膜后加入二抗孵育2 h，洗膜后显色定影，采用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，计算目的蛋白相对表达。

2.7 RT-qPCR法检测大鼠肾组织PCNA、AktmRNA表达 取适量于第43天冷冻保存的肾组织，提取总RNA并反转录为cDNA，然后进行RT-qPCR分析，反应条件为95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火60 s，共循环40次。引物序列见表1。

表1 引物序列

3 结果

3.1 大鼠一般情况 空白组大鼠反应较灵敏，精神状态佳，进食正常；其余各组造模后精神不振，进食量减少。连续给药治疗6周后，给药组大鼠精神状态及进食量优于模型组，各给药组间大鼠精神状态及进食量无明显差异。第43天对各组大鼠体质量进行记录，与空白组比较，模型组大鼠体质量无明显变化(P>0.05)；与模型组比较，益肾化湿颗粒各剂量组大鼠体质量增加(P<0.05)，缬沙坦组大鼠体质量增加，但差异无统计学意义(P>0.05)；各给药组间体质量差异无明显变化(P>0.05)，见表2。

表2 益肾化湿颗粒对大鼠体质量的影响

3.2 益肾化湿颗粒对MsPGN肾炎大鼠24 h尿蛋白定量的影响 第7天，各组大鼠24 h尿蛋白水平比较无明显差异(P>0.05)。第42天，与空白组比较，模型组24 h尿蛋白水平升高(P<0.05)；与模型组比较，益肾化湿颗粒各剂量组及缬沙坦组24 h尿蛋白水平降低(P<0.05)；各给药组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 益肾化湿颗粒对大鼠24 h尿蛋白定量的影响

3.3 益肾化湿颗粒对MsPGN肾炎大鼠肾功能的影响 第8天，与空白组比较，模型组大鼠血清肌酐水平升高(P<0.01)，尿素氮水平升高，但差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，益肾化湿颗粒各剂量组尿素氮水平降低(P<0.05)，血清肌酐水平降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。第43天，与空白组比较，模型组血清肌酐、尿素氮水平均升高(P<0.05)；与模型组比较，各给药组血清肌酐、尿素氮水平均降低(P<0.05)；各给药组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4 益肾化湿颗粒对大鼠肾功能的影响

3.4 益肾化湿颗粒对MsPGN肾炎大鼠肾组织病理变化的影响 第8天，空白组大鼠肾小球结构基本正常，仅出现极其轻微的系膜细胞增生以及肾间质纤维化，未观察到毛细血管腔受挤压的情况；与空白组比较，模型组大鼠肾组织系膜细胞与系膜基质呈现弥漫性增生，毛细血管管腔部分受到挤压，出现轻度狭窄，提示Thy-1型肾炎大鼠模型制备成功。与空白组比较，模型组大鼠肾小球系膜细胞及基质增生程度评分、肾间质纤维化评分均升高(P<0.05)；各给药组与模型组比较2项评分均无明显变化(P>0.05)。第43天，模型组大鼠肾组织系膜细胞、基质增生、肾间质纤维化较空白组严重，2项评分均高于空白组(P<0.05)；各给药组大鼠肾组织系膜细胞增生及细胞外基质沉积、肾间质纤维化程度较模型组改善，2项评分均低于模型组(P<0.05)；各给药组各评分比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图1、表5。

表5 益肾化湿颗粒对大鼠肾组织病理变化的影响(分，

3.5 益肾化湿颗粒对MsPGN肾炎大鼠肾组织PCNA、Akt、p-Akt蛋白表达的影响 与空白组比较，模型组大鼠肾组织PCNA、p-Akt蛋白表达升高(P<0.05)；与模型组比较，益肾化湿高剂量组和缬沙坦组大鼠肾组织PCNA、p-Akt蛋白表达降低(P<0.05)；各组大鼠肾组织Akt蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图2～3。

3.6 益肾化湿颗粒对MsPGN肾炎大鼠肾组织PCNA、AktmRNA表达的影响 与空白组比较，模型组大鼠肾组织PCNAmRNA表达升高(P<0.05)，AktmRNA表达升高，但差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，各给药组大鼠肾组织PCNA、AktmRNA表达降低(P<0.05)；各给药组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表6。

表6 益肾化湿颗粒对MsPGN肾炎大鼠肾组织PCNA、Akt mRNA表达的影响

4 讨论

目前MsPGN治疗药物主要包括血管紧张素转化酶抑制剂或血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂、糖皮质激素、免疫抑制剂等[8]。根据该疾病本虚标实之证[9-10]，多数医家主张使用益气滋肾、清利湿热等方医治[11]。益肾化湿颗粒是以黄芪、人参为君药，黄芪等为臣药的16味中药组方[12]，具有升阳补脾、益肾化湿功效，用于脾虚湿盛证所致蛋白尿等，对症MsPGN。本研究结果显示，益肾化湿颗粒可增加大鼠体质量，降低24 h尿蛋白水平，改善肾功能，提示对MsPGN有治疗作用。同时，病理结果表明，益肾化湿颗粒能减轻肾小球系膜细胞增生及基质增多，提示其可减轻肾脏病理损伤。

PCNA为DNA聚合酶δ的辅助蛋白[13]，是评价细胞增殖的常用指标之一[14]。有研究证实，在大鼠抗Thy-1肾炎模型造模后第1天，肾小球系膜细胞内PCNA表达上调，提示PCNA能较早反映肾小球系膜细胞的增殖状况[15]。本研究证明，益肾化湿颗粒可降低PCNA蛋白和mRNA表达，提示其可能通过抑制PCNA表达，减少处于增殖状态的肾小球系膜细胞，延缓MsPGN进展。

PI3K/Akt信号通路在肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质沉积过程中发挥了重要作用[16-17]。有研究表明，通过抑制该信号通路可抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖[18]。本研究发现，各组间Akt mRNA和蛋白表达比较差异无统计学意义，益肾化湿颗粒高剂量组p-Akt蛋白表达低于模型组，这可能是由于Akt被磷酸化修饰为p-Akt后具有生物活性[19]，有研究显示，p-Akt可参与抗Thy-1肾炎模型中系膜增生的启动和进展[20]，与本研究结果一致。

综上所述，益肾化湿颗粒能改善MsPGN大鼠蛋白尿、肾功能及肾组织病理损伤，从而保护肾脏功能，延缓肾脏病变，其机制可能与抑制PCNA、p-Akt表达有关。本研究为益肾化湿颗粒治疗MsPGN的相关机制提供了一定的实验基础。