基于HS-SPME-GC-MS的小罗伞根挥发性成分分析条件优化

李德仁 白婷婷 李小佳 成栢吉 吕镇城

基于HS-SPME-GC-MS的小罗伞根挥发性成分分析条件优化

李德仁 白婷婷 李小佳 成栢吉 吕镇城

（惠州学院生命科学学院 广东惠州 516007）

建立基于HS-SPME-GC-MS法的快速测定小罗伞根挥发性成分的方法。以总峰面积为考察指标，在单因素（萃取头极性、萃取温度、萃取时间、平衡时间、解吸时间等）实验的基础上，通过9（34）四因素三水平正交实验进行优化。结果显示：最佳条件为萃取针CAR/DVB/PDMS，萃取温度80℃、平衡时间20 min、萃取时间50 min、解吸时间4 min；在此条件下，从罗浮山小罗伞根部鉴定出27种挥发性成分，主要为-古巴烯（27.59%）、水杨酸甲酯（9.04%）、-姜黄烯（8.58%）、-雪松烯（8.46%）。本研究结果可为快速分析小罗伞根的挥发性成分提供科学依据。

小罗伞根；挥发性成分；顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法；萃取条件优化

小罗伞学名为山血丹（Lindl），又名血党、活血胎，属于紫金牛科（Myrsinaceae）紫金牛属（）灌木，具有活血调经、祛风散瘀、消肿止痛等功效，药用部位主要是根部[1-2]。目前，对其研究主要集中在化学成分方面[3-4]。小罗伞根部是制作罗浮山百草油的68种原料之一。罗浮山百草油是国家级非物质文化遗产，传承至今已有1 600多年历史。小罗伞根挥发性成分是评价其药材质量的重要指标，但是，目前鲜见有关广东罗浮山小罗伞根挥发性成分的报道。因此，有必要建立一种基于HS- SPME-GC-MS技术的快速分析小罗伞根挥发性成分的方法，以期为该药材的质量评价及功效挖掘提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试材 小罗伞于2019年3月采集自广东惠州罗浮山，标本经惠州学院生命科学学院吕镇城博士鉴定为小罗伞（Lindl），将小罗伞根粉碎后过筛备用。

1.1.2 仪器 气相色谱-质谱联用仪7890B- 5977A（Agilent公司，美国）；HP-5MS色谱柱（30 m×250 μm×0.25 μm）（Agilent公司，美国）；自动顶空固相微萃取装置（Agilent公司，美国）。萃取针型号：65 μm PDMS/DVB；50/30 μm DVB/CAR/PDMS；85 μm CAR/PDMS；85 μm PA（美国Agilent公司）。

1.2 方法

1.2.1 单因素实验 分别考察不同极性萃取针（65 μm PDMS/DVB、50/30 μm DVB/CAR/ PDMS、85 μm CAR/PDMS、85 μm PA）、萃取温度（50、60、70、80、90℃）、萃取时间（10、20、30、40、50 min）、平衡时间（10、15、20、25、30 min）和解吸时间（2、4、6、8、10 min）对小罗伞根挥发性成分总峰面积的影响，实验设3次重复。

1.2.2 正交实验设计 在单因素实验基础上，采用CAR/DVB/PDMS萃取针，以萃取温度、萃取时间、解吸时间和平衡时间为因素，进行四因素三水平正交实验（表1），以总峰面积为考察指标，优化小罗伞根挥发性成分的最佳萃取条件。

表1 小罗伞根挥发性成分正交实验因素与水平表

1.2.3 GC-MS分析条件 气相色谱（GC）升温程序：起始温度40℃，以8℃/min速率升温到130℃，再以2℃/min速率升温到150℃，最后以15℃/min速率升到250℃，保留5 min。进样口温度250℃，气质传输口温度280℃；载气为高纯度氮气（99.999%），不分流进样，流速为1.0 mL/min。

质谱（MS）条件：电离方式为EI，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，气质传输线温度280℃；电子能量为70eV，扫描方式选择Scan全扫描模式；质量扫描范围为50～500 m/z。

2 结果与分析

2.1 极性萃取针对小罗伞根挥发性成分影响

由于萃取针纤维涂层极性不同，其对样品的挥发性物质萃取效果也各不相同。从图1可知，不同萃取头吸附的小罗伞根挥发性成分的总面积大小为50/30 μm DVB/CAR/PDMS>85 μm CAR/ PDMS>65 μm PDMS/DVB> 85 μm PA。在这4种不同极性萃取针涂层中，PA属于高极性，CAR/ PDMS属于低极性，而DVB/CAR/PDMS萃取针则介于二者之间，属于中极性，对醇类、醛类、酸类、酮类、酯类等化合物均具有高的吸附性[5]。因此，选择50/30 μm DVB/CAR/PDMS作为萃取针进行后续实验。

图1 不同极性萃取针下小罗伞根挥发性成分总峰面积

2.2 萃取温度对小罗伞根挥发性成分影响

萃取温度是影响挥发性成分从样品里挥发的重要因素。从图2可以看出，在萃取温度50～90℃时，小罗伞根挥发性成分总峰面积随着萃取温度的升高而增大，在90℃时总峰面积最大。但是，萃取温度过高，也可能会导致某些挥发性成分分解或不同的挥发性成分之间发生反应，从而使实验结果失真[5]。有报道指出，萃取温度对萃取效果的影响表现为，升高温度能加快待测组分的运动，促进富集，但过高的温度会影响待测物在气相与涂层间的分配系数，反而不利于萃取的平衡[6]。

图2 不同萃取温度下小罗伞根挥发性成分总峰面积

2.3 平衡时间对小罗伞根挥发性成分影响

平衡时间即加热时间，是样品中的挥发性物质成分在气相中达到平衡所需要的时间。如图3所示，平衡时间从10～15 min时，挥发性成分总峰面积呈上升趋势；而平衡时间在15～30 min时，总峰面积呈现降低的趋势。表明在磁力恒温振摇器振摇作用下，小罗伞根挥发性成分在15 min即达到平衡状态。

图3 不同平衡时间下小罗伞根挥发性成分总峰面积

2.4 萃取时间对小罗伞根挥发性成分影响

由图4可知，在萃取时间10～40 min时，小罗伞根挥发性成分的总峰面积随着萃取时间的增加而逐渐增加，萃取时间为40～50 min时，总峰面积变化不大。结果提示，萃取40 min后，挥发性成分在气相与萃取针之间达到了动态平衡，总峰面积趋于稳定。

图4 不同萃取时间下小罗伞根挥发性成分总峰面积

2.5 解吸时间对小罗伞根部挥发性成分影响

从图5可以看出，随着时间从2～4 min时，挥发性成分的总峰面积随着解吸时间的延长而增大；在4 min以后，总峰面积则随着时间延长而降低。由于解吸温度高达250℃，一方面，待测样品中一些热不稳定成分可能因此而分解；另一方面，长时间的高温解吸会缩短萃取针的使用寿命。结果提示，4 min左右已经能够将大部分挥发性成分从萃取针中解吸出来。

图5 不同解吸时间下小罗伞根挥发性成分总峰面积

2.6 正交实验

通过分析各因素极差可以直观地比较出实验的主次因素，从而选出最优水平。如表2所示，以总峰面积作为考察指标，结果显示，R>R>R>R，表明萃取时间C是影响小罗伞根挥发性成分提取的主要因素；萃取温度次之，第三为平衡时间，第四为解吸时间。根据各因素的极差值大小选出最大值，可以得出最优组合2332，即最优分析条件为：萃取温度80℃、平衡时间20 min、萃取时间50 min、解吸时间4 min。

2.7 小罗伞根挥发性成分分析

在正交实验优化出的萃取条件下，对小罗伞根挥发性成分进行分析，总离子流图TIC见图6。通过GC-MS分析、计算机检索和NIST谱库比对，共鉴定出27个化合物，含量1%以上的成分见表3，主要为-古巴烯（27.59%）、水杨酸甲酯（9.04%）、-姜黄烯（8.58%）、-雪松烯（8.46%）、顺-卡拉马尼烯等（6.91%）等。而产自广西地区的小罗伞根挥发性成分主要有桉叶油醇（11.95%）、龙脑（8.51%）、喇叭茶醇（5.08%）等[4]，表明不同产地的小罗伞根挥发性成分存在一定的差异。

图6 小罗伞根挥发性成分总离子流图

表2 小罗伞根挥发性成分L9（34）正交实验结果与极差分析表

表3 小罗伞主要挥发性化学成分及其相对含量

3 结论

与因素轮换实验法相比，正交实验设计法具有工作量小、数据分析直观简便等优点。本实验首先通过单因素实验考察不同萃取头、萃取温度、平衡时间、萃取时间、解吸时间等对小罗伞根部挥发性成分总峰面积的影响，初步优化萃取条件，并在单因素实验的基础上进行四因素三水平正交实验，得到最优萃取条件为：CAR/DVB/PDMS萃取头，萃取温度80℃、平衡时间20 min、萃取时间50 min、解吸时间4 min。

在小罗伞根的主要挥发性成分中，-古巴烯具有提高细胞抗氧化能力的功效[7]。水杨酸甲酯类物质属于非甾体抗炎药，在临床上常用于解热，镇痛和抗炎[8]。-柠檬烯是精油中常见的香气成分，具有镇咳、祛痰、抑菌等作用[9]。研究表明，香柠檬烯具有抗衰老功效[10]。雪松烯主要存在于雪松叶片中，具有抗炎、调节血糖等作用[11-12]。

综上，本研究建立了一种基于HS-SPME-GC- MS技术的快速分析小罗伞根挥发性成分的方法，明确了罗浮山小罗伞根的挥发性成分，可为小罗伞药材的质量评价提供参考，同时为进一步挖掘其药理作用提供科学依据。

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Optimization of Extraction Conditions of Volatile Components forLindl. Roots Based on HS-SPME-GC-MS

LI Deren BAI Tingting LI Xiaojia CHENG Baiji Lü Zhencheng

(School of Life Science, Huizhou University, Huizhou, Guangdong 516007, China)

To establish a rapid method for the determination of volatile components ofLindl. roots based on HS-SPME-GC-MS. Based on the single factor (polarity of extraction fiber, extraction temperature, extraction time, balance time, desorption time, etc.) experiments, the total peak area was carried out as index,an9(34) orthogonal experiments were carried out to optimize the extraction conditions. The optimum conditions were as follows: CAR/DVB/PDMS extraction head, temperature of 80 ℃, equilibrium time of 20 min, extraction time of 50 min and desorption time of 4 min. Under these conditions, 27 volatile components were identified fromLindl. roots, they were mainly-cubanene (27.59%), methyl salicylate (9.04%),-curcumene (8.58%) and-cedarene (8.46%). The results can provide scientific basis for rapid analysis of the volatile components ofLindl. roots.

roots; volatile components; HS-SPME-GC-MS; optimization of extraction conditions

S567.19

A

10.12008/j.issn.1009-2196.2022.06.016

2022-02-28；

2022-03-16

广东省科技创新战略专项资金项目（No.pdjh2020b0566）。

李德仁（1999—），男，在读本科，研究方向为天然产物化学，E-mail：hzubio@126.com。

吕镇城（1982—），男，博士，副教授，研究方向为天然产物化学，E-mail：szsky@126.com。

（责任编辑 林海妹）