纳米粒子的表面修饰在疫苗佐剂开发中的应用

周珈 综述，申丽娟，刘野 审校

1.昆明医科大学基础医学院病理学教研室，云南 昆明 650500；2.中国医学科学院 北京协和医学院医学生物学研究所，云南 昆明 650118

接种疫苗是预防传染病的有效方法。蛋白亚单位疫苗虽具有良好的安全性，但其免疫原性较弱，需要佐剂辅助增强其免疫反应。疫苗佐剂按其设计原理不同，主要分为两类：①免疫调控佐剂，如免疫刺激分子［细菌毒素、细胞因子和Toll样受体（Tolllike receptor，TLR）］，通过与特异性受体相互作用刺激免疫反应；②疫苗递送型佐剂，包括聚合物纳米颗粒、脂质体等，可保护包裹疫苗在其体内，使抗原不被降解，增强抗原递送的靶向性，增强免疫应答。在过去的几十年中，纳米佐剂的研发已成为疫苗研究领域的重要方向之一，已有报道显示，其可改善免疫增强活性分子的靶向性并克服生物学障碍［1］。在智能纳米医学的发展中，纳米粒子表面修饰的工程化将为粒子特定和精确的功能提供更大的控制范围。

本文对纳米粒子表面修饰在疫苗佐剂中的应用作一综述。

1 佐剂在先天性和适应性免疫应答中的作用

抗原进入人体后，免疫系统会做出反应将其清除，而免疫系统的反应可快可慢。快速反应的先天免疫系统是机体的第一道防线，而适应性免疫系统虽反应缓慢，却提供持久的免疫保护。补体系统和巨噬细胞参与先天免疫。适应性免疫反应则主要通过抗原介导的具有抗原特异性表面受体的T细胞和B淋巴细胞的刺激引发［2］。CD4+T辅助细胞（T helper cell）和CD8+细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）是两种不同类型的T细胞，Th细胞又分为不同的Th1和Th2细胞亚群。ALSON等［3］发现，用破伤风类毒素进行预处理，再接种基于肿瘤细胞的疫苗可使肿瘤生长退化，并提高小鼠存活率。破伤风类毒素的预处理增强了脾脏免疫功能，提高了淋巴细胞的增殖率及脾细胞的IFNγ、TNF-α和IL-4抗原特异性分泌水平，从而提高了免疫反应。用破伤风类毒素进行预处理可增加记忆T细胞向肿瘤部位和脾脏的迁移。在破伤风类毒素和基于肿瘤细胞疫苗组合疫苗接种的小鼠中，也发现抗原特异性细胞毒性T细胞对肿瘤细胞毒杀伤效率更高。先天免疫细胞表达模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR），有助于检测病原菌。C型凝集素样受体（C-type lectin，CLR）、核苷酸结合寡聚化结构域样受体（nucleotide-binding domain leucine-rich repeat，NLR）、TLR和视黄酸诱导基因1样受体（retinoic acid inducible gene-1-like receptor，RLR）是不同系列的PRR。TLR和CLR存在于抗原呈递细胞（antigen presenting cells，APC）表面，而NLR和RLR位于细胞内。病原相关分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）是存在于真菌、病毒、细菌和寄生虫等病原微生物中的分子模式［3］。一般来说，佐剂通过免疫细胞中的PRR激活先天免疫系统。大多数免疫刺激佐剂作为PRR的配体，通过直接增强激活途径导致细胞因子的分泌［4-6］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作为TLR的配体，能够激活TLR4，poly（I：C）激活TLR3，鞭毛蛋白可被TLR5识别，咪唑喹啉可被TLR7／8识别，胞嘧啶-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸可被TLR9识别［5］。

因此，与PRR的各种配体结构相似的佐剂可激活各自的受体，从而刺激先天免疫。而单磷酰脂类A引发Th1反应，霍乱毒素刺激Th2反应。Th1反应涉及细胞介导的免疫，而Th2细胞激活体液反应以中和细胞外抗原。

2 佐剂的作用方式

佐剂可通过免疫调节、抗原提呈、靶向作用、抗原储存作用以及诱导CD8+细胞毒T细胞应答中的一种或几种来发挥作用。不同类型的佐剂其作用方式不同导致了免疫调节能力的差异性。

2.1 抗原储存作用 如明矾或油基乳剂这样的佐剂为短期储存抗原，具有缓慢释放抗原和抗降解作用，从而达到持久刺激免疫系统，通过靶向抗原至APC显示其佐剂活性，导致主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）分子增强抗原在APC上的提呈，并刺激适应性免疫反应［7］。然而，佐剂在增强MHC分子抗原提呈以促进适应性免疫反应中的作用尚未得到明确评价。

2.2 免疫调节作用 免疫调节佐剂指先于或同时与抗原免疫机体时，增强机体对抗原的特异性免疫应答，并通过细胞因子触发免疫系统。首先，佐剂通过增加某些细胞因子的浓度而降低其他细胞因子的浓度来影响免疫类型［8］。IFNγ、IL-2和IL-12与Th1应答和细胞介导免疫相关，而IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13与Th2应答和体液免疫相关。卡介苗、细菌内毒素、脂质A衍生物、单磷酰脂质A通过刺激Th1反应发挥作用［9］。

2.3 靶向作用 含糖类佐剂如皂苷、壳聚糖、中药多糖等具有通过APC向免疫效应细胞提呈抗原的能力。将免疫原吸附于壳聚糖聚合物或其他糖类时，可增加抗原对巨噬细胞和树突状细胞的传送。壳聚糖及衍生物作为佐剂对机体免疫系统的调节作用主要表现在：增强疫苗的穿透、吸收和保护作用；免疫刺激性活动。壳聚糖的胺基在酸性介质中带正电荷，并与带负电荷的黏膜表面或其他大分子（如遗传物质）产生强烈的静电作用。基于壳聚糖的佐剂系统已被证明具有15种黏液黏附性质，并具有独特的能力，可打开上皮细胞间的紧密连接，并通过另一种有效的抗原传递途径促进抗原转运，从而刺激强大的黏膜免疫反应。大量研究证实，壳聚糖的黏附特性能够延长制剂在黏膜部位的停留时间，包括鼻黏膜、胃肠道和生殖道黏膜［10-11］。细菌菌壳（bacterial ghost，BG）是一种具有显著天然佐剂特性的疫苗传递系统。BG是革兰阴性菌的空细菌壳，缺乏细胞质，但保留了其表面形态和结构特征［12］。专业的APC可通过模式识别受体识别BG的表面成分，使其成为通过口腔、眼、鼻或气道黏膜给药的理想系统。疫苗佐剂和给药系统是通过黏膜途径在体内诱导有效免疫反应的最佳选择。壳聚糖衍生物纳米颗粒是最有前途的黏膜疫苗载体，可保护抗原不被降解，增加抗原在黏膜表面的停留时间，通过配体受体相互作用将抗原靶向至M细胞，在免疫系统中大量递送抗原，有效诱导系统和黏膜免疫［13］。

3 纳米粒子表面修饰及其在疫苗佐剂中的应用

纳米粒子是指粒度1～1 000 nm的颗粒，具有相邻的界面层［14］。纳米材料具有良好的生物相容性、黏膜吸附性、生物降解性、易加工和修饰、促进功能分子进入细胞、保护DNA和蛋白质不被降解等优点。通过物理、化学方法对粒子表面进行改性，改善了纳米粒子的分散性，提高了微粒表面活性，使微粒表面产生新的性能。纳米技术在医学中的出现改善了药物的溶解性、膜渗透性、药物靶向性和控释性［15-16］。但在复杂的生物系统中，纳米医学面临着清除速度快、缺乏适当的相互作用、非特异靶向性、无法进入靶细胞和组织核心等障碍［17-18］。因此，粒子的表面修饰为专门定制功能和开发智能纳米粒子提供了另一个控制维度。

3.1 金属纳米棒表面修饰 为增强疫苗引发的免疫应答，通过使用能激活免疫细胞的化学分子对纳米材料进行表面修饰。疫苗引发的免疫不仅依赖于抗原的摄取，还依赖于免疫细胞的激活。激活的免疫细胞会引发更强的免疫反应。纳米银是目前报道的唯一可以抑制HIV的纳米材料，LIU等［19］基于银纳米棒对其进行聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙二醇（PEG）表面修饰，可显著提高HIV疫苗的关键免疫能力。虽然单独使用PVP或对其进行表面修饰均能在体外有效激活免疫细胞，但纳米材料表面修饰可形成多价效应，促进分子的功能。因此与单独使用PVP相比，PEG修饰的PVP纳米材料能更好地增强免疫应答，延长了纳米材料在体内的循环时间，优化了材料的生物相容性。通过对纳米材料进行表面修饰以达到预期的免疫调节功能，从而优化疫苗诱导的免疫反应。MI等［20］首次提出添加叶酸的金纳米棒在较低电场强度下可实现更高的抗瘤效果。叶酸对具有良好生物相容性的PEG-金纳米棒表面进行进一步修饰，可对A375黑素瘤细胞进行特异性靶向识别，有效抑制黑色素瘤的增殖。

3.2 聚合物纳米粒子 聚乳酸-乙醇酸（PLGA）纳米粒子和表面修饰的PLGA纳米粒子因其可控释放特性和生物相容性而被广泛用作抗原或药物载体［21］。然而，大多数PLGA纳米颗粒的抗原加载效率和调节能力较低。表面阳离子聚合物修饰可通过表面吸附提高PLGA纳米粒子的抗原加载效率［22］。WUSLMAN等［23］和LIU等［24］研究了壳聚糖修饰的PLGA纳米粒子（CS-AHPP／OVA）、聚乙烯亚胺修饰的PLGA纳米粒子（PEI-AHPP／OVA）和ε-聚-L-赖氨酸修饰的PLGA纳米粒子（εPL-AHPP／OVA）。通过对表面阳离子聚合物改性后，AHP和OVA负载的PLGA纳米粒子（AHPP／OVA）带正电荷，并保持了结构完整性。通过表面阳离子聚合物改性，改善了其抗原负载能力和纳米粒子的稳定性，增加的正表面电荷导致更大的OVA吸附能力。AHPP／OVA、CS-AHPP／OVA、PEI-AHPP／OVA和εPL-AHPP／OVA制剂显著促进淋巴细胞增殖并增加了CD4+／CD8+T细胞的比例。此外，AHPP／OVA、PEI-AHPP／OVA和εPL-AHPP／OVA制 剂 诱 导 了 细 胞 因 子（TNF-α、IFNγ、IL-4和IL-6）抗体（IgG）和抗体亚型的分泌（免疫小鼠中的IgG1和IgG2a）。表明以上制剂产生了强烈的Th1偏向免疫应答。

3.3 脂质体 传统脂质体的局限性之一是其在血液中的循环时间短，因为易被检测为外来物质，并被免疫系统降解。研究发现，叶酸、多肽、蛋白、糖基作为配体对脂质体进行表面修饰时，可增强脂质体稳定性，延长其在体内的循环时间，提高生物利用度［25］。OBEROI等［26］证明，包含TLR4激动剂CRX-601佐剂的PEG修饰的脂质体与甲基乙二醇壳聚糖组合，可增强鼠对流感疫苗免疫的舌下免疫反应。在鼠流感疫苗模型中，研究者通过对脂质体进行磷脂-PEG共轭物和壳聚糖表面修饰，使机体产生免疫反应，与未修饰的脂质体相比，携带CRX-601佐剂表面修饰的脂质体疫苗可显著改善流感特异性应答，实现强效的黏膜和全身免疫反应。HAERI等［27］通过对脂质体进行表面改性，如PEG脂质体、配体靶向脂质体和多功能脂质体，克服了传统脂质体缺陷。在肿瘤疫苗佐剂应用中能够靶向病变细胞，具有高度的特异性，从而避免损伤健康组织。

3.4 聚多巴胺修饰的纳米颗粒 近年来，聚多巴胺（PDA）的发现为纳米颗粒作为药物载体的表面功能化和生物医学应用提供了新的思路。其聚合产物PDA能够附着在几乎所有材料表面，包括金属、陶瓷、半导体和合成聚合物［28］。PDA改性使纳米颗粒具有更强的亲水性、良好的生物相容性、适当的生物降解性、强的光热转换能力和活性氧清除能力。因其独特的多功能，PDA修饰的纳米颗粒在肿瘤治疗、抗菌、疫苗和佐剂、组织修复等领域引起了广泛关注［29］。LIU等［30］通过对聚乳酸-乙醇酸聚合物进行PDA表面修饰使聚乳酸-乙醇酸聚合物具有模拟病原体的结构，这种新型疫苗佐剂增强了细胞因子的分泌和免疫细胞的招募，在体内可诱导更强的体液和细胞免疫反应。

4 小结与展望

佐剂的使用是提高亚单位疫苗免疫原性的理想方式。纳米粒子的表面修饰是对佐剂的免疫调节和靶向作用进行优化的良好策略。纳米颗粒的大小和形态在抗原的传递中起重要作用，也极大影响了颗粒在体内的分布。通过控制纳米颗粒的尺寸、形状和表面特性，以及控制反应条件等方法优化纳米粒子，在不引起副作用和毒性的基础上增强免疫反应，才能将佐剂应用于临床和实现商品化。