酵母抽提物FM888对CHO细胞生长的影响

万莹铚，李秋霞，张宏岐，邹坤，肖萌，伍业旭，张松，邓锐

1.三峡大学生物与制药学院 三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室，湖北 宜昌 443002；2.三峡大学医学院，湖北 宜昌 443002；3.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003；4.湖北宏裕新型包材股份有限公司，湖北 宜昌 443000

酵母抽提物（yeast extract，YE）是以酵母为主要原料，通过酵母自身酶解自溶（可再经分离提取），再经干燥后获得的粉末状产品，为一类蛋白水解物，富含氨基酸、肽、多肽等酵母细胞中可溶性成分［1-2］。近年，随着采用哺乳动物细胞培养技术生产的抗体、重组蛋白药物及疫苗等生物制品市场的扩大，YE作为可支持细胞生长及其产物表达的有效添加剂，在生产抗体类药物工艺中具有重要作用，具有广阔的应用前景［3-4］。YE作为血清的代替或营养物质的补充物添加至无血清培养中，可规避血清和动物源蛋白水解物存在的免疫原性及病毒、支原体等微生物的污染风险，同时能够提高重组蛋白的表达水平，且具有同批次间组分差异小、产品质量稳定性高等优点［5-6］。近年研究发现，YE对细胞传代扩增和批式培养中细胞生长及抗体表达均具有正向影响［7-8］，但目前YE在CHO细胞培养过程中的作用及应用策略的系统性研究较少。

YE FM888可明显促进CHO细胞生长，具有高溶解性、营养源高度富集、低内毒素等特点。本研究以CHO悬浮细胞为研究对象，探讨FM888对CHO细胞生长代谢和周期凋亡的影响，以期为FM888在动物细胞悬浮培养领域的应用及高效无血清培养基的开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞 细胞株CHOK1-1122sp20购自常州艾米能斯生物科技有限公司。

1.2 主要试剂及仪器EmCD CHO®Medium培养基购自常州艾米能斯生物科技有限公司；FM888购自安琪酵母股份有限公司；细胞周期试剂盒和细胞凋亡试剂盒均购自江苏凯基生物技术股份有限公司；台盼蓝溶液购自美国Thermo公司；乳酸脱氨酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatinekinase，CK）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；M-900型生物过程生化分析仪购自深圳市西尔曼科技有限公司；7020型全自动生化分析仪购自日本HITACHI公司；FACS Verse型流式细胞仪购自美国BD公司。

1.3 细胞培养 将细胞株CHOK1-1122sp20复苏后，用EmCD CHO®Medium培养基重悬，取30 mL，接种至125 mL摇瓶中，于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养，摇床转速为165 r／min。每48 h进行种子细胞传代扩增，传代后活细胞密度控制在（4～6）×105个／mL。

1.4 FM888对CHO细胞生长影响的检测 取第4代对数生长期的CHO细胞，183×g离心5 min，弃上清，用EmCD CHO®Medium培养基重悬。按约1.0×106个／mL的活细胞密度接种于12孔板中，1 mL／孔，分别添加FM888至终浓度为1、2、3、5 g／L，同时设空白对照组（不加FM888），继续培养7 d。取培养0～7 d的细胞悬液100 μL，与台盼蓝按1∶1的比例混匀，采用细胞计数仪计数，并计算定活细胞密度及细胞活率。

1.5 FM888对CHO细胞生化代谢影响的检测 取第4代对数生长期的CHO细胞，183×g离心5 min，弃上清，用EmCD CHO®Medium培养基重悬。按约1.0×106个／mL的活细胞密度接种于125 mL摇瓶中，接种体积为60 mL，分别添加FM888至终浓度为1、2 g／L，同时设空白对照组（不加FM888），继续培养。取培养0～7 d的细胞悬液，采用M-900型生物过程生化分析仪检测葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸和铵根离子含量。以培养时间为横坐标，各生化指标含量为纵坐标，绘制CHO细胞生化代谢趋势图。

1.6 FM888对CHO细胞中多种酶活力影响的检测取1.5项中0～7 d细胞悬液，采用相应试剂盒检测LDH、CK、ALT、AST的活力。

1.7 FM888对CHO细胞周期影响的检测 取1.5项培养5 d的CHO细胞5 mL细胞液，733×g离心5 min，收集细胞，PBS洗涤1次，重复离心1次，收集细胞，调整浓度为1×106个／mL。取1 mL细胞悬液，733×g离心5 min，弃上清，加入70%冷乙醇500 μL，4℃固定过夜；PBS洗涤1次，183×g离心3 min，弃上清，加入PI／RNaseA染色液500 μL，室温避光放置30～60 min，采用流式细胞仪检测细胞周期。

1.8 FM888对CHO细胞凋亡影响的检测 取培养5 d的CHO细胞液1 mL，733×g离心5 min，收集细胞，PBS洗涤2次，重复离心1次，收集细胞，调整浓度为（1～5）×105个／mL，加入500 μL的Binding Buffer及5 μL的Annexin V-FITC，混匀，再加入5 μL的Propidiumlodide，混匀，室温避光反应5～15 min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.9 统计学分析 应用SPSS 21.0软件进行统计学分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较釆用单因素方差分析，两组间均数的比较釆用最小显著差数（LSD）法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FM888对CHO细胞生长的影响 不同FM888浓度条件下，CHO活细胞密度及活率均于培养5 d时达到峰值，随后迅速下降。培养1～5 d，与空白对照组比较，1及2 g／L FM888浓度组的活细胞密度均明显高于空白对照组，3及5 g／L FM888浓度组均明显低于空白对照组（F=16.307～279.804，P＜0.05）；培养6及7 d，各浓度FM888组活细胞密度差异无统计学意义（F分别为2.879和4.808，P＞0.05）。1及2 g／L FM888浓度组前5 d内的细胞活率均保持在80%以上，3 g／L FM888浓度组前4 d内细胞活率在80%以上，5 g／L FM888浓度组仅在前2 d内细胞活率在80%以上；与空白对照组比较，各浓度FM888组除1及7 d（F分别为3.008和3.207，P均＞0.05）外，其他培养天数的细胞活率均有统计学意义（F=4.288～52.152，P均＜0.05）。见图1。表明1、2 g／L的FM888可促进CHO细胞生长，确保培养过程中维持较高活细胞密度和细胞活率。因此，采用1、2 g／L的FM888进行后续试验。

图1 各组CHO细胞活细胞密度（A）及细胞活率（B）Fig.1 Viable density（A）and viability（B）of CHO cells in various groups

2.2 FM888对CHO细胞生化代谢的影响

2.2.1 葡萄糖1、2 g／L FM888组细胞的葡萄糖浓度在培养0、1 d时均明显高于空白对照组（F分别为7.010和7.139，P均＜0.05），2～5 d时明显低于空白对照组（F=6.970～18.105，P均＜0.05），6、7 d时各组细胞的葡萄糖浓度趋近于0。见图2。表明加入FM888可增加细胞对葡萄糖的消耗量。

图2 各组CHO细胞葡萄糖的代谢情况Fig.2 Metabolism of glucose of CHO cells in various groups

2.2.2 谷氨酰胺1、2 g／L FM888组细胞的谷氨酰胺浓度在培养0～3 d时均显著低于空白对照组（F=6.518～26.621，P均＜0.05），4 d时低于空白对照组，但差异无统计学意义（F=4.333，P＞0.05），5～7 d时谷氨酰胺浓度为0。见图3。表明加入FM888可增加细胞对谷氨酰胺的消耗量。

图3 各组CHO细胞谷氨酰胺的代谢情况Fig.3 Metabolism of glutamine of CHO cells in various groups

2.2.3 谷氨酸1、2 g／L FM888组细胞的谷氨酸浓度在培养0～7 d时均显著高于空白对照组（F=5.558～145.333，P均＜0.05）。见图4。表明加入FM888可增加细胞谷氨酸的生成量。

图4 各组CHO细胞谷氨酸的代谢情况Fig.4 Metabolism of glutamate of CHO cells in various groups

2.2.4 乳酸 各组CHO细胞的乳酸浓度于培养0～4 d时呈上升趋势，培养前2 d，1、2 g／L FM888组乳酸浓度高于空白对照组（F分别为4.019和16.000，P均＜0.05）；培养3 d时趋近于空白对照组，差异无统计学意义（F=1.010，P＞0.05）；4 d时显著低于空白对照组（F=31.902，P<0.05），5～7 d时呈下降趋势，且6 d时，1、2 g／L FM888组显著低于空白对照组（F=14.362，P<0.05）。见图5。表明加入FM888可降低细胞乳酸的生成量。

图5 各组CHO细胞乳酸的代谢情况Fig.5 Metabolism of lactate of CHO cells in various groups

2.2.5 铵根离子 培养1～4、6、7 d，1 g／L FM888组胞的铵根离子浓度显著高于空白对照组，2 g／L FM888组于培养1 d时显著低于空白对照组，2～4、6、7 d时显著高于空白对照组（F=5.558～145.333，P均<0.05）；1和2 g／L FM888组于培养5 d时与空白对照组差异无统计学意义（F=4.473，P＞0.05），见图6。表明加入FM888可增加细胞均铵根离子的生成量。

图6 各组CHO细胞铵根离子的代谢情况Fig.6 Metabolism of ammonium ions of CHO cells in various groups

上述结果表明，培养基中加入FM888，整个培养周期中，谷氨酰胺浓度均低于空白对照组；培养前期，葡萄糖、乳酸和铵根离子在培养体系中的浓度均高于空白对照组，表明FM888的添加一定程度上能够促进细胞代谢活动。培养后期，含有FM888培养组中营养物质的消耗及代谢产物的积累均随着培养时间的延长而逐渐下降。

2.3 FM888对CHO细胞中多种酶活力的影响 培养前5 d，FM888组细胞培养液中的LDH、CK、ALT、AST活力趋近于空白对照组。培养6和7 d时4种酶的活力急剧上升，于培养6 d时，1和2 g／L FM888组的LDH、CK、ALT、AST活力显著低于空白对照组（F分别为66.521、11.713、9.045、69.129，P均<0.05）；于培养7 d时，1和2 g／L FM888组的LDH、ALT、AST活力显著低于空白对照组（F分别为13.699、25.134、146.690，P均<0.05），CK活力差异无统计学意义（F=11.230，P＞0.05）。见图7。表明加入1和2 g／L的FM888可减少细胞损伤及CHO细胞酶的释放。

图7 细胞培养液中LDH（A）、CK（B）、ALT（C）、AST（D）的酶活Fig.7 Enzyme activity of LDH（A），CK（B），ALT（C）and AST（D）in cell culture medium

2.4 FM888对CHO细胞周期的影响 与空白对照组比较，1、2 g／L FM888组细胞G1期的比例减少11.40%和3.70%，差异有统计学意义（F=32.43，P<0.01）；S期细胞比例增加17.18%和5.75%，差异有统计学意义（F=69.42，P<0.01）；G2／M期细胞比例降低44.99%和15.95%，差异有统计学意义（F=33.42，P<0.01）。见图8和表1。表明添加1和2 g／L的FM888能促进细胞从G1期进入S期，从而促进细胞增殖。

图8 不同浓度FM888对CHO细胞周期分布的影响Fig.8 Effects of various concentrations of FM888 on CHO cell cycle distribution

2.5 FM888对CHO细胞凋亡的影响 与空白对照组比较，1、2 g／L FM888组细胞凋亡率分别减少15.24%和13.92%（F=163.3，P<0.01），见图9和表1。表明随着FM888浓度的增加，活细胞的比例随之升高，凋亡细胞比例降低，FM888能抑制细胞的凋亡，从而促进细胞增殖。

表1 各组CHO细胞的细胞周期比例及凋亡率（%,±s，n=3）Tab.1 Cell cycle proportions and apoptosis rates of CHO cells in various groups（%，±s，n=3）

表1 各组CHO细胞的细胞周期比例及凋亡率（%,±s，n=3）Tab.1 Cell cycle proportions and apoptosis rates of CHO cells in various groups（%，±s，n=3）

注：与空白对照组比较，a表示P<0.05，aa表示P<0.01。

组别 细胞凋亡率细胞周期比例G1 S G2／M空白对照组 43.893±1.799 43.253±2.104 12.853±0.381 30.833±1.406 1 g／L FM888组 32.493±1.865aa 60.437±0.838aa 07.070±1.154aa 15.588±1.069aa 2 g／L FM888组 40.197±1.635a 49.000±2.189a 10.803±0.915a 16.918±0.900aa

图9 不同浓度FM888对CHO细胞凋亡的影响Fig.9 Effects of various concentrations of FM888 on apoptosis of CHO cells

3 讨论

YE是酵母由自身水解酶完成自溶后产生的水溶性成分，不同于植物水解物，其不受植物种类、来源、地理位置及外源水解酶等各方面因素的影响，YE在一定程度上还能够控制自溶，有更好的稳定性。同时，已有多种快速、低成本的方法用于YE的鉴定与筛选［9］。因此将YE用于生产抗体、疫苗等生物制剂工艺中具有一定优势，已广泛应用于完全培养基的设计及生物反应器的细胞流加培养中，如已开发出添加YE的无血清培养基用于培养昆虫Tn5B1-4细胞和CHO细胞［5，10］；YE对于重组CHO细胞悬浮培养中人血小板生成素（human thrombopoietin，hTPO）、IgG和Fc融合蛋白等目标蛋白的表达也具有明显的促进作用［7-11］。

课题组前期研究表明，YE FP103可替代部分血清，为CHO细胞的生长提供所需营养，同时，对大量YE进行了细胞实验考察，从中筛选出能支持的CHO悬浮细胞高密度生长的抽提物FM888［12］。FM888以纯化培养的高品质酵母为原料，采用先进的生物定向降解和膜处理等方法制备而成，产品有望替代国际同类产品应用于基因工程重组蛋白、透明质酸、疫苗等高端发酵领域，但缺乏其在CHO细胞培养过程中作用及使用策略的系统性研究。本研究在前期研究基础上，较系统地探讨了FM888对CHO悬浮细胞生长的影响。细胞生长检测结果显示，1和2 g／L的FM888能够促进CHO细胞的生长，3和5 g／L的FM888可抑制CHO细胞的生长。有研究证实，葡萄糖是CHO细胞的主要能源物质之一［13］；葡萄糖在无氧或缺氧条件下，生成丙酮酸，丙酮酸在一系列酶的作用下生成乳酸［14］，当培养基中葡萄糖消耗，乳酸浓度过高时，细胞会改变代谢模式，消耗乳酸［15］。CHO细胞生化代谢检测结果显示，在培养前期，含有FM888培养条件下，葡萄糖、乳酸、谷氨酸和铵根离子在培养体系中的浓度高于空白对照组，谷氨酰胺含量低于空白对照组；培养后期，含有FM888培养组中营养物质的消耗及代谢产物的积累均随着培养时间的延长而逐渐下降，表明FM888的添加一定程度上能够促进细胞的代谢活动。本研究结果还显示，添加FM888可降低在营养缺乏下CHO细胞养液中LDH等酶的释放，增强CHO细胞的耐受性。流式细胞术结果显示，1、2 g／L FM888组G1期细胞比例减小，S期细胞比例明显增大，促进细胞从G1期进入S期，且能影响CHO细胞的周期分布，有利于CHO细胞的增殖，同时可减少CHO细胞凋亡率，抑制细胞凋亡，促进CHO细胞增殖。

综上所述，1及2 g／L的FM888能通过调节CHO细胞生化代谢、细胞周期分布，抑制凋亡促进CHO细胞的生长和增殖，其作用机制还有待于深入研究。本研究为FM888作为无血清培养基添加剂在细胞培养中的应用提供了实验依据。