自噬与炎症小体相互作用对干性年龄相关性黄斑变性影响的研究进展

毕鸿昊，郭惠怡，陈强

年龄相关性黄斑变性（age-related maculardegeneration，AMD）被认为是造成全世界约9%的失明病例的原因[1]，临床上分为干性AMD 与湿性AMD。干性AMD的早期会出现玻璃膜疣与脂褐素沉积等病理表现，随着病情进展还会出现地图样萎缩等变化。近年来关于AMD 的研究虽然逐渐增多，但是AMD 的发病机制尚不明确，现在仍未发现有效治疗AMD 的方法。自噬是真核生物体内维持机体生命活动正常进行的途径之一，核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein3，NLRP3）炎症小体是机体内的促炎物质，两者之间存在相互作用[2]，且都在干性AMD 的发病中发挥着重要作用。本文将针对自噬与NLRP3 炎症小体的相互作用对干性AMD 产生的影响进行综述，探讨两者在治疗干性AMD 方面的潜在应用前景。

1 自噬与干性AMD

1.1 自噬的分子机制

自噬广泛存在于真核生物中，是指溶酶体对细胞内的大分子物质以及受损细胞器进行降解的过程，降解之后的部分代谢产物可被细胞重新利用，继续参与细胞内的物质循环。自噬分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬。本研究主要介绍的是巨自噬与干性AMD的关系及其相互作用。

巨自噬的整个过程分3 个阶段：起始/成核阶段、伸长和成熟阶段、融合和降解阶段[3],不同的自噬相关蛋白（autophagy-related protein，Atg）在不同阶段发挥着重要作用。在营养缺乏等条件下，机体的自噬水平会迅速升高。自噬的启动需要unc51 样激酶1（UNC-51-like kinase 1，ULK1）复合体的参与。ULK1 是一种细胞质激酶，其复合体组成包括ULK1 以及自噬相关蛋白Atg13、FIP200（Atg17 同系物）与Atg101[4]。自噬开始后首先有分隔膜的形成，ULK1复合体与III 类磷脂酰肌醇-3-激酶复合物（class III PI3K complex，PI3KC3）共同辅助这个阶段的进行。人卷曲螺旋肌球蛋白样Bcl-2 结合蛋白（coiled-coil myosin-like Bcl-2-interacting protein，Beclin1）、Atg14、空泡分选蛋白15（vacuolar protein sorting15，VPS 15）、空泡分选蛋白34（vacuolar protein sorting 34，VPS 34）组成了PI3KC3，该物质能将磷脂酰肌醇磷酸化成磷脂酰肌醇3 磷酸（phosphatidylinositol 3-phosphate，PI3P），用于成核和形成杯状双层膜[5]。分隔膜伸长阶段需Atg5-Atg12-Atg16L-1 复合物与微管相关蛋白轻链3Ⅰ/Ⅱ-磷脂形成的共轭系统来发挥作用[6]，分隔膜延长后逐渐包裹待降解产物，最终形成拥有双层膜结构的自噬体，自噬体与溶酶体结合形成自噬溶酶体，在溶酶体酶的作用下对自噬底物进行降解。

1.2 自噬在干性AMD中的作用

1.2.1 自噬、氧化应激与干性AMD 干性AMD 存在多种病理改变，包括视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）变性、玻璃膜疣出现、脂褐素沉积等。自噬对这些病理改变有调控作用，在某种程度上可以通过减弱这些病理改变对RPE 细胞的损伤，从而延缓疾病的发生与发展。视网膜是眼睛中耗氧量较多的部位，在生命活动中会产生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS)。一般情况下细胞内存在ROS 的清除体系，抗氧化酶如过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶[7]等均可维持细胞内ROS 的生成与清除平衡。细胞出现饥饿等应激情况会造成ROS 的积累，继而出现损伤。BAEK A 等[8]研究发现，自噬可防止视网膜受氧化应激损伤，而慢性氧化应激降低了RPE 细胞自噬能力，加重细胞损伤。MITTER SK 等[9]的实验通过将ARPE-19 细胞暴露在H2O2中建立了急性和慢性AMD 模型，经过14 d 的观察后发现急性氧化应激刺激自噬活性，而慢性氧化应激降低自噬活性，可见氧化应激对自噬的影响要根据其缓急程度来确定。此外，氧化应激能导致脂褐素的形成，脂褐素的主要成分为N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺（N-retinyliden-Nretinylethanolamine，A2E），SAADAT KA 等[10]的实验发现当ARPE-19 细胞与A2E 一起孵育时，会有自噬诱导的发生。A2E单独给药时不会导致RPE 细胞死亡，A2E与自噬抑制剂共同作用则会促进细胞死亡，证明了自噬对RPE 细胞的保护作用。总之，在氧化应激的过程中，自噬能通过抑制ROS的产生减缓干性AMD的发生。

1.2.2 自噬、炎症与干性AMD 炎症在干性AMD 发病中的作用也不可忽视，炎症反应是指机体在遭受内部或外部刺激后对细胞和组织损伤做出的防御性反应[11]。在干性AMD中，急性炎症一般不作为主要致病因素，相对于急性炎症来说，慢性炎症对RPE 细胞有更加长期而持续的作用。在它的持续作用下，RPE细胞逐渐发生病理改变。玻璃膜疣是干性AMD 的主要特征之一，沉积在RPE 基底膜与Bruch 膜之间，内含多种炎性成分，如免疫球蛋白、C 反应蛋白、补体成分等。补体作为在免疫和炎症反应中发挥重要作用的蛋白，被激活后相继产生C3 转化酶、膜攻击复合物（membrane attack complex，MAC）[12]，后者能对RPE 细胞产生攻击，参与RPE 细胞死亡，这些证据都表明炎症在干性AMD 的发病中占据重要地位。自噬可以调节炎症反应，PU Q 等[13]通过实验发现，脓毒症小鼠被敲除自噬基因Atg7 后，自噬功能相较于野生型小鼠受到抑制，且伴有严重的肺损伤和炎症反应的增强，说明了自噬能对炎症进行调节。此外，炎症因子对自噬也存在影响，WU MX 等[14]用实验证明了白细胞介素-33（interleukin-33，IL-33）能逆转db/db 小鼠以及棕榈酸（palmitic acid，PA）处理的细胞中出现的自噬损害，且能促进自噬。氧化应激与炎症是影响干性AMD 发病的两大因素，自噬通过对活性氧的清理以及对炎症反应的调节在干性AMD的疾病进程中发挥作用。

2 NLRP3炎症小体与干性AMD

2.1 NLRP3炎症小体的概述

炎症小体在炎症反应中起重要作用，NLRP3炎症小体是由NLRP3 蛋白、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD domain，ASC）以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cysteinyl aspartate specific protease-1，Caspase-1）共同组成的高分子蛋白复合物[15]。NLRP3 是NLRP3炎症小体的核心蛋白，包含一个中心核苷酸结合寡聚化结构域，C 端的亮氨酸重复序列（leucinerich repeat，LRR）结构域、以及N 端热蛋白（pyrin domain，PYD）结构域[16]。NLRP3 蛋白含有PYD 结构域，ASC 蛋白含有PYD 结构域和CARD 结构域。NLRP3 蛋白通过自身的PYD 与ASC 相互作用，然后ASC 的CARD 结构域与前Caspase-1 的CARD 结构域结合后形成炎症小体，ASC在整个过程中起衔接作用。炎症小体形成后通过切割pro-Caspase-1 生成Caspase-1。这种具有成熟酶活性的物质，可将白细胞介素前体pro-IL-1β和pro-IL-18 剪切为促炎因子白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18，促进炎症的发生。炎症小体的激活有多种途径，线粒体ROS 的大量生成、细胞中钾离子外流造成的低钾环境、溶酶体破裂释放组织蛋白酶B 等[17-18]均能激活NLRP3 炎症小体。它的激活分为启动和激活2 个阶段。NLRP3 和pro-IL-1β 的转录、翻译在启动阶段发挥着重要作用，NLRP3 的去泛素化也与该阶段有关。Toll 样受体（tolllike receptor，TLR）激活核转录因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）后，NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18 的表达也随之增加，有利于之后的炎症小体形成。NLRP3易被泛素化，泛素化使NLRP3 活性被抑制[19]。启动信号出现后，NLRP3在去泛素化酶的作用下去泛素化，重新具备活性并参与炎症小体的组装。激活阶段有许多刺激源，如细胞外三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、尼日利亚菌素[20]、氧化硅、铝盐[21]等都是NLRP3 炎症小体的激活因素，激活后的炎症小体能促进机体的炎症反应，导致许多疾病的发生。

2.2 炎症小体对干性AMD的影响

研究[22-23]表明，炎症小体在糖尿病、动脉粥样硬化、阿尔茨海默症、自身炎症性疾病以及各种神经退行性疾病中均发挥重要作用，其中NLRP3 在AMD 中表达显著上调[24]。NLRP3炎症小体属于多蛋白复合物[25]，激活后能促进促炎因子IL-1β，IL-18 的成熟和分泌，扩大炎症反应的影响。炎症小体一般由免疫细胞合成[26]，RPE 虽然不是免疫细胞，但也能产生NLRP3 炎症小体，参与炎症反应与RPE 变性。研究[27]表明，以NLRP3 炎症小体或IL-18 为靶点能抑制RPE 变性。目前有实验证实了x-连锁凋亡抑制蛋白（x-linked inhibitor of apoptosis，XIAP）是炎症小体介导的IL-18 和IL-1β 分泌过程的负调控因子，XIAP 位于Caspase-1 的下游，对RPE细胞中细胞因子的分泌有调节作用，炎症小体的激活可能导致XIAP 的减少[28]，进而影响XIAP 对炎症过程和RPE 细胞分泌细胞因子过程的调节，在某种程度上造成AMD 的发病。IL-1β，IL-18的分泌需要NLRP3炎症小体，但IL-1β相比于IL-18更加严格依赖NLRP3炎症小体。BHATTARAI N[29]的实验研究了氢醌对人RPE 细胞中NLRP3 炎症小体的激活及相关炎症因子的分泌，发现氢醌能够诱导ARPE-19 细胞分泌IL-18，而不激活NLRP3 炎症小体，探明了吸烟过程中IL-18 的分泌为非NLRP3 依赖途径。此外，机体存在一种病理机制称为“细胞焦亡”，是指一种促炎程序性细胞死亡途径，该机制需要NLRP3 炎症小体的中心酶Caspase-1 的作用[30]，NLRP3 炎症小体激活后会活化Caspase-1，介导细胞的程序性死亡，导致AMD 的发生。HUANG P 等[31]的实验探究了E3泛素连接酶31（tripartite motif-containing protein 31，TRIM31）对ARPE‐19 细胞的影响，发现TRIM31 与ARPE‐19细胞中的NLRP3存在相互作用，能促进NLRP3的泛素化，抑制炎症小体的形成，TRIM31 通过促进该泛素过程抑制了人RPE 细胞中的NLRP3 炎症小体表达和细胞焦亡。NLRP3 炎症小体还能参与他莫昔芬诱导的RPE 细胞死亡，HWANG N等[32]的实验发现柳氮磺吡啶能抑制Caspase-1 介导的炎症，减轻他莫昔芬诱导的RPE 细胞的死亡，证明NLRP3 炎症小体作为AMD 的治疗靶点是可行的。炎症作为干性AMD 的致病因素之一，与NLRP3 炎症小体关系密切，NLRP3 炎症小体也因为在AMD中的重要作用，所以具有较好的研究前景。

3 自噬与炎症小体在干性AMD中的作用

NLRP3炎症小体作为促进炎症因子分泌的物质，与自噬的相互作用过程对干性AMD 的发病有重要影响。干性AMD 属于退行性疾病，它的发病与视网膜重要功能部分的退化有关，主要是由RPE 细胞、光感受器和脉络膜毛细血管的老化造成[33]。自噬具有维持细胞内环境稳态的作用，自噬出现紊乱会导致视网膜细胞死亡，加速AMD 的病理进程[34]。RPE 细胞自噬失败时，可能导致脂褐素的聚集和NLRP3 炎症小体的激活，促进视网膜核仁形成和低度慢性炎症的发生，促进机体和细胞衰老[35]。NLRP3炎症小体与自噬之间的相互作用，首先表现在自噬能去除NLRP3 炎症小体激活因子，如细胞内源性激活物、NLRP3 炎症小体成分、细胞因子等，减轻炎症小体激活和炎性反应[36]，自噬也可以通过去除有缺陷的线粒体下调炎症体的激活[37]，此外，炎症小体不仅被自噬抑制，也能反过来抑制自噬。LPS 诱导的炎症会导致NLRP3炎症小体蛋白增加，这是由于自噬通量受损所致。褪黑素可以通过恢复LPS 诱导的自噬通量阻断，发挥抗炎作用，证明了自噬与NLRP3 炎症小体之间的相互作用[38]。研究[39]证明，使用极化的人RPE 细胞片进行实验，A2E 会引起明显的自噬损害，并同时上调自噬的负性调节因子Rubicon。由于A2E是脂褐素的主要成分，证明了脂褐素对自噬的抑制作用。同时，脂褐素样物质能使体外培养的RPE 细胞对溶酶体的光毒性更敏感，导致NLRP3 炎症小体活化和炎性细胞因子的分泌[40]。白藜芦醇是一种自噬激动剂[41]，具有抗氧化与抗炎的作用。白藜芦醇在眼病的相关治疗中能有效防止细胞内活性氧（intracellular reactive oxygen species，iROS）和炎性标志物IL-6、IL-8的产生增加，减少脂褐素表达[42]，且具有抑制NLRP3炎症小体激活的作用[43]，表明自噬抑制了脂褐素诱导的NLRP3 炎症小体的激活。柯玲玲等[44]在探究驻景丸加减方对干性AMD 小鼠视网膜的保护作用时，发现驻景丸加减方可激活核因子E2 相关因子2（nuclear factorerythroid2-related factor2，Nrf2）通路，促进自噬，减少代谢废物在RPE下的沉积。研究[45]证明，雷帕霉素通过诱导自噬的发生来抑制NLRP3 炎症小体激活，而Nrf2 能部分介导雷帕霉素抑制线粒体活性氧（mitochondrial reactive oxygen species，mtROS）的作用[46]，调控NLRP3 炎症小体的激活。故此可以推测驻景丸发挥作用的机制之一是通过自噬对NLRP3炎症小体的抑制作用来实现的。至于干性AMD 的病理表现之一玻璃膜疣，其成分中的β-淀粉样蛋白（amyloidβ，Aβ）也与NLRP3 及自噬有关。研究[47]表明，Aβ 沉积能促使小胶质细胞活化，激活NLRP3炎症小体，而NLRP3炎症小体又能进一步促进Aβ 沉积，对细胞造成损伤。抑制小胶质细胞自噬后能增强NLRP3炎症小体活化[48]，促进自噬能抑制NLRP3炎症小体的活化，证明了自噬可以通过抑制炎症小体减少Aβ 的沉积[49]。从以上分析可知，自噬与NLRP3 炎症小体都在干性AMD 的疾病进程中发挥着重要作用，且它们两者之间存在相互影响，这种相互的作用机制与干性AMD 的发病有关。

4 小结

干性AMD是与NLRP3炎症小体及自噬关系密切的黄斑疾病。NLRP3 炎症小体能促进机体炎症的发生，加剧干性AMD 的发病，而干性AMD 中表现出的玻璃膜疣及脂褐素等病理改变又能进一步激活NLRP3 小体，促进炎症因子的分泌。自噬可以通过抑制NLRP3小体的激活减缓其对AMD的影响。自噬与NLRP3炎症小体都对AMD的发生发展意义重大，目前正在探索治疗AMD 更为有效的方法，自噬与炎症小体间的相互作用可能会为这种探索提供新的治疗思路，为干性AMD患者带来新的希望。