IPI-504通过LINC00312/let-7b-5p/EBF1轴抑制胰腺癌细胞的增殖和迁移

胡耀元，谭晓冬，李锐

（中国医科大学附属盛京医院普通外科，沈阳 110004）

胰腺癌是最致命的肿瘤之一，也是癌症相关死亡的主要原因之一［1］。胰腺癌患者预后不良的主要原因是手术切除率低、对放化疗敏感性差、复发和转移率高。手术切除加围术期化疗是胰腺癌的标准治疗方法，但疗效不理想。由于胰腺癌组织中血液供应不良和免疫抑制微环境，化疗药物难以在肿瘤内达到有效的治疗浓度［2］。因此，开发有效的胰腺癌治疗药物刻不容缓。热休克蛋白（heat shock protein，HSP）90抑制剂在体外具有抗胰腺癌活性。IPI-504是一种HSP90抑制剂，在水中高度溶解且耐受性良好，是一种有前途的癌症治疗药物［3］。因此，探究IPI-504抑制胰腺癌进展的机制对促进其广泛应用十分必要。

本研究前期通过生物信息学分析筛选出IPI-504处理后上调且在胰腺癌组织中下调的LINC00312。研究［4-5］表明，LINC00312在多种癌症中发挥抑癌作用，但尚无研究报道其在胰腺癌中的作用。众所周知，长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）通过与mRNA竞争结合微RNA（microRNA，miRNA），调节miRNA下游靶基因表达。本研究进一步分析与LINC00312结合的miRNA，发现let-7家族与LINC00312结合，且生物信息学分析显示，let-7b-5p高表达的胰腺癌患者总生存率低。研究［6］表明，let-7b-5p在多种癌组织中表达上调，从而促进癌症进展。此外，let-7b-5p在胰腺癌患者血清中上调，可能作为胰腺癌诊断的依据［7］。LINC00312是否结合let-7b-5p并在肿瘤中发挥调控作用，目前尚无研究报道。此外，本研究前期还预测了let-7b-5p的下游靶基因，并筛选出在胰腺癌中下调且在IPI-504处理的胰腺癌细胞中下调的let-7b-5p下游靶基因，包括SVEP1、ADAMTS3、ADCY1和早期B细胞因子1（early B cell factor 1，EBF1）。EBF1是位于人类染色体5q34上的转录因子，研究［8］表明，其表达在胰腺导管腺癌组织中下调，其敲低增加癌细胞活力和迁移，其在胰腺癌中的具体作用及机制有待进一步分析。因此，本研究探究了IPI-504介导的LINC00312/let-7b-5p/EBF1轴对胰腺癌细胞增殖和迁移的作用，并分析LINC00312、let-7b-5p和EBF1间的靶向关系，从而为探索胰腺癌诊断和治疗方法提供新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和仪器

人胰腺癌PANC-1细胞，购自武汉普诺赛生命科技有限公司。IPI-504购自美国MCE公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒、化学发光检测系统购自美国Promega公司；总RNA提取、实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）和逆转录试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；BCA试剂盒购自美国Thermo公司；EBF1抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；倒置显微镜购自日本奥林巴斯公司；酶标仪购自上海中庸检验设备有限公司；qRT-PCR仪购自瑞士Roche公司；普通PCR仪购自美国ABI公司；全自动化学发光分析系统购自上海天能科技有限公司。

1.2 双荧光素酶报告基因实验

通过lncRNASNP2数据库（https：//bioinfo.life.hust.edu.cn/lncRNASNP#!/）预测let-7b-5p与LINC00312的结合位点，通过ENCORI数据库预测let-7b-5p与EBF1mRNA的结合位点。将PANC-1细胞分为LINC00312-WT+NC mimics 组、LINC00312-WT+let-7b-5p mimics组、LINC00312-MUT+NC mimics 组、LINC00312-MUT+let-7b-5p mimics组、EBF1-WT+NC mimics组、EBF1-WT+let-7b-5p mimics组、EBF1-MUT+NC mimics 组和EBF1-MUT+let-7b-5p mimics组，按照Lipofectamine 3000转染试剂说明书进行转染。LINC00312-WT+NC mimics 组细胞转染包含let-7b-5p与LINC00312潜在结合位点序列的野生型质粒（LINC00312-WT）和NC mimics；LINC00312-WT+let-7b-5p mimics组转染LINC00312-WT和let-7b-5p mimics；LINC00312-MUT+NC mimics 组转染包含let-7b-5p与LINC00312潜在结合位点突变序列的突变型质粒（LINC00312-MUT）和NC mimics；LINC00312-MUT+let-7b-5p mimics组转染LINC00312-MUT和let-7b-5p mimics；EBF1-WT+NC mimics 组转染包含let-7b-5p与EBF1mRNA潜在结合位点序列的野生型质粒（EBF1-WT）和NC mimics；EBF1-WT+let-7b-5p mimics组 转染EBF1-WT和let-7b-5p mimics；EBF1-MUT+NC mimics 组转染包含let-7b-5p与EBF1mRNA潜在结合位点突变序列的突变型质粒（EBF1-MUT）和NC mimics；EBF1-MUT+let-7b-5p mimics组转染EBF1-MUT和let-7b-5p mimics。继续培养24 h后检测相对荧光素酶活性。

1.3 细胞培养和转染

PANC-1细胞用含10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM高糖培养基在37 ℃、含5% CO2的恒温细胞培养箱中培养。将细胞分为对照组、IPI-504组、IPI-504+敲减对照组、IPI-504+敲减LINC00312组、IPI-504+NC mimics 组、IPI-504+let-7b-5p mimics组和IPI-504+敲减EBF1组。对照组细胞不做处理；IPI-504组细胞加入终浓度1 μmol/L IPI-504处理48 h；IPI-504+敲减对照组细胞转染敲减对照质粒；IPI-504+敲减LINC00312组转染敲减LINC00312质粒；IPI-504+NC mimics 组转染NC mimics；IPI-504+let-7b-5p mimics组转染let-7b-5p mimics；IPI-504+敲减EBF1组转染敲减EBF1质粒。IPI-504+敲减对照组、IPI-504+敲减LINC00312组、IPI-504+NC mimics 组、IPI-504+let-7b-5p mimics组和IPI-504+敲减EBF1组细胞于转染后24 h加入终浓度1 μmol/L IPI-504。加入IPI-504后24 h，收集各组细胞进行后续实验。

1.4 qRT-PCR

取转染后24 h的各组细胞，TRIzol法提取细胞总RNA，将RNA反转录成cDNA，严格按照SYBR qRT-PCR试剂盒说明书进行qRT-PCR 。反应条件为95℃预变性30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s循环反应，40个循环。以GAPDH或U6为内参，根据2-△△Ct法计算LINC00312和EBF1mRNA或let-7b-5p的相对表达量。引物序列：LINC00312，正向5’-AAGCGAACCAAGC CAATA-3’，反向5’-CAAATCCCTGAAACTCTG-3’；EBF1，正向5’-AGCTTCTCTACAGCAATGGGAT-3’，反向5’-TGAGCAAGACTCGGCACATT-3’；GAPDH，正向5’-TCATTTCCTGGTATGACAACGA-3’，反向5’-GTCTTACTCCTTGGAGGCC-3’；let-7b-5p，正向5’-GCGCTGAGGTAGTAGGTTGTG-3’，反向5’-GTG CAGGGTCCGAGGT-3；U6，正向5’-GTGCTCGCTTCG GCAGCACATATAC-3’，反向 5’-AAAAATATGGAAC GCTCACGAATTTG-3’。

1.5 CCK-8法

将各组细胞以5×103/孔的密度接种于96孔板中，培养过夜后取出板，弃培养基，加入CCK-8检测液，37 ℃孵育1 h，酶标仪检测450 nm处吸光度值。

1.6 Transwell实验

将各组细胞以1×105/孔的密度接种于Transwell小室上室，向上室中加入无血清培养基，下室中加入含20%胎牛血清的培养基，继续培养24 h后取出上室，PBS洗涤后加入4%多聚甲醛，室温固定10 min，PBS洗涤3次，结晶紫染色1 h，蒸馏水漂洗，倒置显微镜下观察和拍照。

1.7 Western blotting

收集细胞，使用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法定量蛋白，煮样，上样于聚丙烯酰胺凝胶，电泳分离蛋白，将蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，一抗4 ℃孵育过夜，PBST洗膜，二抗室温孵育1 h，PBST洗膜，ECL化学发光，使用ImageJ软件进行灰度分析。

1.8 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。数据均符合正态分布，以表示，多组间的比较采用单因素方差分析，并采用Tukey事后检验进行组间两两比较。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LINC00312与let-7b-5p以及let-7b-5p与EBF1的靶向关系

生物信息学分析结果显示，let-7b-5p与LINC00312（图1A）以及let-7b-5p与EBF1mRNA存在结合位点（图1B）。双荧光素酶报告基因实验结果（图1C、1D）显示，LINC00312-WT+let-7b-5p mimics组与LINC00312-WT+NC mimics 组比较，EBF1-WT+let-7b-5p mimics组与EBF1-WT+NC mimics 组比较，PANC-1细胞相对荧光素酶活性显著降低（P＜ 0.05）；LINC00312-MUT+let-7b-5p mimics组与LINC00312-MUT+NC mimics组比较，EBF1-MUT+let-7b-5p mimics组与EBF1-MUT+NC mimics 组比较，PANC-1细胞相对荧光素酶活性无统计学差异（P＞ 0.05）。

图1 LINC00312、EBF1 mRNA与let-7b-5p结合Fig.1 LINC00312 and EBF1 mRNA combined with let-7b-5p

2.2 IPI-504通过LINC00312影响胰腺癌细胞增殖和迁移

qRT-PCR结果（图2A）显示，与对照组比较，IPI-504组和IPI-504+敲减对照组PANC-1细胞LINC00312表达显著升高，let-7b-5p表达显著降低（P＜ 0.05）；与IPI-504组和IPI-504+敲减对照组比较，IPI-504+敲减LINC00312组PANC-1细胞LINC00312表达显著降低，let-7b-5p表达显著升高（P＜ 0.05）。

CCK-8结果（图2B）显示，与对照组比较，IPI-504组和IPI-504+敲减对照组PANC-1细胞增殖活性显著降低（P＜ 0.05）；与IPI-504组和IPI-504+敲减对照组比较，IPI-504+敲减LINC00312组PANC-1细胞增殖活性显著升高（P＜ 0.05）。

Transwell结果（图2C）显示，与对照组比较，IPI-504组和IPI-504+敲减对照组PANC-1细胞穿膜细胞数显著降低（P＜ 0.05）；与IPI-504组和IPI-504+敲减对照组比较，IPI-504+敲减LINC00312组PANC-1细胞穿膜细胞数显著升高（P＜ 0.05）。

图2 IPI-504通过LINC00312影响胰腺癌细胞的增殖和迁移Fig.2 IPI-504 affects pancreatic cancer cell proliferation and migration through LINC00312

2.3 IPI-504通过let-7b-5p影响胰腺癌细胞增殖和迁移

qRT-PCR结果（图3A）显示，与对照组比较，IPI-504组和IPI-504+NC mimics 组PANC-1细胞let-7b-5p表达显著降低（P＜ 0.05）；与IPI-504组和IPI-504+NC mimics组比较，IPI-504+let-7b-5p mimics组PANC-1细胞let-7b-5p表达显著升高（P＜ 0.05）。

CCK-8结果（图3B）显示，与对照组比较，IPI-504组和IPI-504+NC mimics组PANC-1细胞增殖活性显著降低（P＜ 0.05）；与IPI-504组和IPI-504+NC mimics组比较，IPI-504+let-7b-5p mimics组PANC-1细胞增殖活性显著升高（P＜ 0.05）。

Transwell结果（图3C）显示，与对照组比较，IPI-504组和IPI-504+NC mimics组PANC-1细胞穿膜细胞数显著降低（P＜ 0.05）；与IPI-504组和IPI-504+NC mimics组比较，IPI-504+let-7b-5p mimics组PANC-1细胞穿膜细胞数显著升高（P＜ 0.05）。

图3 IPI-504通过let-7b-5p影响胰腺癌细胞的增殖和迁移Fig.3 IPI-504 affects pancreatic cancer cell proliferation and migration through let-7b-5p

2.4 IPI-504通过EBF1影响胰腺癌细胞的增殖和迁移

Western blotting结果（图4A）显示，与对照组比较，IPI-504组和IPI-504+敲减对照组PANC-1细胞EBF1蛋白表达显著升高（P＜ 0.05）；与IPI-504组和IPI-504+敲减对照组比较，IPI-504+敲减LINC00312组PANC-1细胞EBF1蛋白表达显著降低（P＜ 0.05）。

CCK-8结果（图4B）显示，与对照组比较，IPI-504组和IPI-504+敲减对照组PANC-1细胞增殖活性显著降低（P＜ 0.05）；与IPI-504组和IPI-504+敲减对照组比较，IPI-504+敲减EBF1组PANC-1细胞增殖活性显著升高（P＜ 0.05）。

Transwell结果（图4C）显示，与对照组比较，IPI-504组和IPI-504+敲减对照组PANC-1细胞穿膜细胞数显著降低（P＜ 0.05）；与IPI-504组和IPI-504+敲减对照组比较，IPI-504+敲减EBF1组PANC-1细胞穿膜细胞数显著升高（P＜ 0.05）。

图4 IPI-504通过EBF1影响胰腺癌细胞的增殖和迁移Fig.4 IPI-504 affects pancreatic cancer cell proliferation and migration through EBF1

3 讨论

多种lncRNA参与胰腺癌进展，如MACC1-AS1在胰腺癌组织中高表达且高表达患者生存率低，其沉默抑制胰腺癌细胞的增殖和转移能力［9］。LINC00976在胰腺癌组织和细胞系中上调，且与患者的不良生存率相关，其沉默在体内和体外抑制胰腺癌的增殖、迁移潜力和侵袭性［10］。LINC00312是在鼻咽癌中发现的一个基因间lncRNA［11］。其过表达抑制肝细胞肝癌细胞增殖，促进细胞凋亡，下调细胞周期蛋白B1并诱导G2～M细胞周期停滞，从而在肝细胞肝癌中发挥抑癌作用［12］。还有研究［13］发现，LINC00312在非小细胞肺癌组织中表达下调，其表达降低与肿瘤体积增加和晚期相关，LINC00312在体内外均能抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。此外，LINC00312还能通过直接结合转录因子Y-Box结合蛋白1诱导肺癌细胞的迁移、侵袭和血管生成拟态［14］。MIN等［15］发现，LINC00312在甲状腺癌组织和细胞中低表达，沉默LINC00312促进甲状腺癌细胞的侵袭和增殖。多项研究证实LINC00312在多种癌症中发挥抑癌作用，但目前尚无LINC00312在胰腺癌中作用的研究。本研究在体外验证了IPI-504处理增加胰腺癌细胞LINC00312表达，且敲减LINC00312逆转了IPI-504对胰腺癌细胞增殖和迁移的抑制作用，表明IPI-504通过上调LINC00312表达抑制胰腺癌细胞的增殖和迁移。

众所周知，lncRNA通过海绵化miRNA调节其靶基因表达。因此，本研究预测了与LINC00312结合的miRNA，发现let-7b-5p与LINC00312结合。研究［6］表明，let-7b-5p在卵巢癌和前列腺癌中发挥促癌作用。本研究发现，IPI-504处理降低胰腺癌细胞let-7b-5p表达，过表达let-7b-5p逆转了IPI-504对胰腺癌细胞增殖和迁移的抑制作用，表明IPI-504诱导的LINC00312可能通过海绵化let-7b-5p抑制胰腺癌细胞增殖和迁移。进一步分析let-7b-5p下游靶基因，发现EBF1mRNA与let-7b-5p存在潜在结合位点。本研究进一步验证LINC00312/let-7b-5p轴是否通过靶向调节EBF1表达发挥作用。EBF1是参与多种细胞谱系的分化和成熟的DNA结合转录因子，其基因缺失有助于B祖细胞急性淋巴细胞白血病的耐药性和复发［8］。本研究发现，IPI-504处理增加胰腺癌细胞EBF1蛋白表达，敲减LINC00312能够降低IPI-504处理的胰腺癌细胞EBF1蛋白表达。此外，敲减EBF1逆转了IPI-504对胰腺癌细胞增殖和迁移的抑制作用，表明IPI-504通过LINC00312/let-7b-5p/EBF1轴抑制胰腺癌细胞的增殖和迁移。

综上所述，本研究发现，IPI-504上调的LINC00312通过海绵化let-7b-5p上调EBF1表达，从而抑制胰腺癌细胞的增殖和迁移，为IPI-504作为胰腺癌的潜在治疗药物提供了理论依据。