氧化应激反应在边缘供肝肝移植缺血-再灌注损伤中的作用研究进展

高伟东 杨龙龙 尹清臣

肝移植是各种终末期肝病唯一有效的治疗方式，随着肝移植技术的不断成熟以及等待移植人数的急剧增多，供肝严重短缺，大量边缘供肝被逐渐应用于肝移植中。边缘供肝一般是指肝移植术后存在移植物原发性无功能（primary nonfunction，PNF）、移植物功能延迟恢复（delayed graft function，DGF）等风险的供肝[1]。常见的边缘供肝主要包括脂肪变性供肝、高龄供肝、小体积供肝、心脏死亡器官捐献（donation after cardiac death，DCD）供肝等。虽然边缘供肝的应用扩大了供肝的范围，但相较于正常肝脏其发生缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）的风险更高。肝脏IRI是指肝脏在阻断入肝血流一段时间后恢复血流供应肝脏结构及功能损伤并未恢复，反而加重的现象，是肝叶切除及肝移植手术中不可避免的问题，影响患者术后恢复[2]。研究显示过量活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）介导的氧化应激反应是导致肝脏IRI重要的机制[3]，且在边缘供肝肝移植IRI表现更为明显，因此若能够有效控制边缘供肝肝移植过程的氧化应激反应，便能有效地提高边缘供肝肝移植的成功率。

1 氧化应激反应

氧化应激反应是指机体产生过多ROS超过自身抗氧化防御能力，从而损伤蛋白质、脂质和DNA的状态。ROS是包括超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（OH-）和臭氧（O3）等在内的氧的还原产物的统称[4]。ROS产生的主要部位是细胞内线粒体呼吸链复合物，其可将电子传递给氧，当氧不完全还原时，ROS便作为该过程的副产物产生，其中的络合物Ⅰ和Ⅲ是线粒体内ROS的主要来源。此外，细胞色素酶和还原性辅酶Ⅱ也可参与产生ROS。正常情况下，低浓度ROS对于细胞维持正常生理活性是必不可少的，参与信号传导、基因表达、生物合成、细胞生长等生理过程[5-6]。由于抗氧化系统的存在，细胞产生ROS的能力和清除ROS的效率处于动态平衡，氧化还原平衡得以维持，此过程称为ROS稳态[7]。例如，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）可将ROS转化为H2O2，然后通过H2O2酶予以清除。然而，在肝移植过程中IRI不可避免，各种来源的ROS产生增加，破坏了这一微妙的平衡，增加的ROS消耗内源性抗氧化剂，此时虽可代偿性增加抗氧化酶的表达，以维持氧化还原平衡，但当损伤持续发生时，代偿反应不足以纠正失衡的氧化还原状态，则引起氧化应激损伤，进而导致无菌性炎症反应和肝细胞凋亡、坏死，甚至导致移植失败。

2 ROS在边缘供肝肝移植IRI中的作用及防治要点

肝脏是人体第二大器官，由于其具有双重血供的特点，肝细胞习惯于富氧环境，故而对缺血缺氧损伤更为敏感。如何减轻肝移植IRI是众多学者不断探讨的问题，在肝脏IRI早期ROS已开始升高并对肝细胞产生损伤，在后期无菌性炎症反应时中性粒细胞和巨噬细胞被激活并在肝脏中积聚，这些细胞通过释放ROS和炎症因子加剧IRI[8]。因此，ROS介导的氧化应激反应贯穿IRI整个过程，而边缘供肝的自身特性导致氧化应激反应在其IRI中对肝细胞损伤更为严重。

2.1 脂肪变性供肝

随着全球肥胖率的上升，10%～24%的世界人口患有肝脂肪变性，并且预计在将来会继续上升[9]。尸体和活体供肝中都常发现肝脂肪变性，有研究显示，供肝中有9%～26%存在脂肪变性[10]，由于部分供肝存在严重脂肪变性，大约40%的供肝被舍弃[11]。因此，使用脂肪变性供肝进行移植成为了研究的热点。肝脂肪性变性依据脂肪变性程度分为轻度（＜30%）、中度（30%～60%）和重度（＞60%），有研究认为供肝脂肪变性程度＜60%时可用于肝移植，重度脂肪变性供肝的应用会导致移植肝初期肝功能不良和PNF发生率增高，轻至中度脂肪变性供肝对于肝移植远期预后无明显影响[12]。

ROS对脂肪变性供肝细胞的损伤程度较正常肝细胞明显增加[13-14]。Zhao等[15]认为这可能是由于沉积在肝细胞中的多余脂肪是过氧化反应的靶标，且肝脂肪变性过程中，肝细胞体积增大，窦状隙受挤压，导致脂肪变性供肝处于相对缺血的环境，对外界刺激较为敏感[8,16]。越来越多的证据表明肝脂肪变性与线粒体功能障碍有关，肝脂肪变性会引起线粒体形态变化和功能障碍，包括类结晶包涵体产生，线粒体DNA表达水平降低以及线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的活性降低，从而引起ROS产生增多以及三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）合成减少，过量的ROS产生会增强脂质过氧化作用，攻击细胞膜产生脂质过氧化产物丙二醛（malondialdehyde，MDA）[17-20]。此外，Zhang等[21]证实ROS还可直接氧化线粒体膜脂质和线粒体蛋白，改变其结构和功能特性，导致线粒体损伤。由于线粒体功能受损，致使线粒体呼吸链复合物产生更多ROS，而ROS又进一步攻击线粒体，导致线粒体中ROS的产生不断增多，这一ROS产生自我增强的过程，被称为“ROS诱导的ROS释放”[22]。线粒体受损不能产生足够的ATP，进而导致细胞水肿，而过量的ROS会通过内源性及外源性途径启动细胞凋亡[23]。

抑制过量ROS产生可阻止线粒体和肝细胞进一步损伤，Zhang等[24]使用鸢尾素作用于肝脂肪变性缺血-再灌注小鼠模型及HL7702脂肪变性细胞缺氧/复氧模型，结果显示鸢尾素可明显减少肝细胞内ROS生成，并改善线粒体功能、抑制肝细胞炎症反应及坏死，最终减轻肝脂肪变性小鼠肝脏IRI。此外，肝脂肪变性和IRI之间的相互作用进一步促进了巨噬细胞的激活和积累，IRI过程诱导巨噬细胞从肝微循环中募集，活化的巨噬细胞产生肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α等促炎介质，诱导血管内皮细胞黏附分子表达，刺激趋化因子产生，导致中性粒细胞的募集，释放更多的ROS和蛋白酶，进一步对肝脏造成损伤[25]。以巨噬细胞为靶点，Thurman等[26]使用三氯化钆选择性破坏肝脂肪变性大鼠体内巨噬细胞后可以抑制ROS的形成并改善微循环，从而减轻肝脏IRI，阻止肝细胞凋亡。

2.2 高龄供肝

随着我国人口老龄化加剧，高龄供肝在供肝池中所占比例势必逐渐增多。在供肝短缺的情况下高龄供肝可以在一定程度上扩大供肝来源，但受者术后发生移植肝衰竭和死亡的风险亦相对升高。在现有的研究中一般将高龄供肝定义为年龄＞60岁供者肝脏[27-28]。过去认为与青少年相比，老年人肝脏的血流量和总容积略有下降，近些年研究表明在正常情况下，这种减少不会导致明显的肝功能损害，但会影响肝脏对IRI的敏感性[29]。老年人肝脏的自由基总量明显高于年轻人，过氧化脂质和MDA含量明显上升，SOD活性及多不饱和脂肪酸/总脂肪酸比值显著下降[30]。

衰老方面的实验研究主要基于啮齿动物模型，Okaya等[31]比较了12～13月龄小鼠和8～12周龄小鼠在70%肝脏IRI模型中的损伤情况，结果表明老年小鼠肝脏损伤更为严重。Park等[32]使用9月龄大鼠及3月龄大鼠分别建立70% 肝脏IRI模型后得出了类似结论。衰老过程会加重肝脏氧化应激反应，随着机体的衰老，氧化损伤在肝脏线粒体中不断积累，细胞内线粒体功能发生一系列变化，主要为呼吸链氧化磷酸化酶活性降低，电子传递受阻，ATP合成减少，自由基产生增多[33-34]。此外，在IRI发生发展过程中一氧化氮（nitric oxide，NO）亦参与机体氧化应激反应，NO由NO合酶（NO synthase，NOS）合成，主要存在3种亚型，即神经元型NOS（neuronal NOS，nNOS）、内皮型NOS（endothelial NOS， eNOS）和诱导型NOS（inducible NOS，iNOS），iNOS产生高浓度NO可加重氧化应激损伤，而eNOS产生的低浓度NO可抑制ROS产生。研究表明与成年大鼠相比，老年大鼠IRI后肝脏iNOS水平明显增加，eNOS水平明显下降，褪黑素是松果体产生的一种ROS清除剂，可明显降低机体iNOS含量，增加eNOS含量，减轻高龄供肝氧化应激反应[35-36]。

2.3 小体积供肝

小体积供肝是指供肝体积小于标准肝体积的40%或移植物与受者质量比为0.8%～1.0%，最常见于劈离式肝移植。劈离式肝移植是根据肝脏Couinaud分段理论将一个完整的供肝分成2个或2个以上的解剖功能单位移植到不同的受者中，可以扩大20%～30%的供肝来源，是缓解供肝短缺的重要方式[37]。临床通常将供肝劈分为左外叶和右三叶或者左、右半肝，以增加肝脏利用率。虽然劈离式供肝选择标准明显高于普通供肝，但因移植物质量与受者不匹配而引起的小肝综合征严重影响受者预后，目前认为在劈离式肝移植中移植物与受者质量比应大于1.0%才能够有效避免小肝综合征的发生[38-39]。

小体积供肝相较于正常供肝更易受到IRI影响，小体积供肝较全肝移植会产生更多ROS，而ROS不仅可以诱导细胞凋亡及炎症，还可以致使肝细胞DNA受损，抑制肝细胞分裂，延缓小体积供肝移植后生长[40-41]。因此，通过增强机体抗氧化系统，清除体内过量的ROS对小体积供肝移植显得至关重要。Cui等[42]使用SOD模拟物（MnTBAP）作用于小体积供肝移植大鼠模型，发现与对照组相比，使用MnTBAP处理可明显降低大鼠术后血清MDA、转氨酶、炎症因子水平，促进移植肝的肝细胞增殖，表明增强机体抗氧化水平可以明显降低肝脏氧化应激反应及炎症反应。Zhang等[43]通过体内及体外实验也得到相似结果，即通过过表达eNOS促使机体产生大量NO可以抑制ROS生成。实验结果表明，与对照组相比，过表达eNOS后大鼠体内NO含量明显增多，同时明显改善大鼠肝功能及减少肝细胞凋亡，遗憾的是这两项实验并未直接观察ROS生成情况。而Zhong等[41]的实验表明具有ROS清除能力的山茶多酚可以明显减少小体积供肝移植中ROS含量，减弱脂质过氧化反应，减少肝细胞坏死、白细胞浸润，提高大鼠术后存活率。

2.4 心脏死亡器官捐献供肝

DCD供肝在心脏停搏过程中，不可避免地经历低血压、缺氧等热缺血过程，热缺血时间过长会影响供肝质量、延长移植肝功能恢复时间，甚至引起移植肝失活[44-45]。DCD供肝在热缺血期间，随着缺血时间延长，供肝受到的氧化应激损伤不断增加。魏宝龙等[46]通过建立功能性热缺血大鼠肝移植模型，用于比较不同热缺血时间对供肝损伤的影响，结果表明与对照组相比，肝脏在热缺血开始时已发生氧化应激损伤，且随着缺血时间增加损伤不断加剧。因此，DCD供肝应用于临床首要问题便是尽可能减少心脏停搏后供肝热缺血过程中的再灌注损伤。

体外膜肺氧合（extracorporeal membrane oxygenation，ECMO）是一种使用体外循环设备短暂替代心肺功能，为全身器官供氧的技术，可有效缓解由于器官缺氧导致的氧化应激损伤，主要用于暂时为严重呼吸和心功能不全患者提供支持治疗。在DCD供者中应用ECMO可减轻器官IRI，同时为移植前充分评估供肝及受者情况及制定手术方式提供时间[47]。Sun等[48]观察了在摘取供肝前应用ECMO以使热缺血时间＜10 min对患者预后影响，数据表明6例受者肝功能及凝血功能在短时间内恢复正常，随访2年无受者死亡及移植物失功发生。Jiménez-Galanes等[49]比较了脑死亡供肝与ECMO支持下的DCD供肝肝移植的预后情况，结果表明两者之间差异无统计学意义。若将ROS清除剂加入灌注液中并不断检测灌注液中ROS浓度，以使ROS处于合适浓度，则可将ROS在肝移植IRI中的损伤作用转变为保护作用。因此，在DCD供者中应用ECMO可扩大供者来源并提高获取器官的质量，改善受者预后。ECMO的应用虽取得不错效果，但仍存在一些问题需不断完善，如ECMO置管时机的选择，ECMO运行时间及流量的不统一等[47]。

3 小 结

综上所述，由ROS介导的氧化应激反应在边缘供肝肝移植IRI中扮演重要角色，减少肝脏IRI时大量产生的ROS对于减轻肝脏IRI具有重要意义。但是，ROS并非对机体总是具有破坏作用，有研究表明低浓度ROS可通过激活自噬反应、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B （phosphatidylinositol 3-kinase /protein kinase B，PI3K/Akt）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路在肝脏IRI中起到保护作用[23]。因此，最理想的方式应是将ROS浓度控制在对肝脏IRI具有保护作用时的最适浓度范围。遗憾的是，最适浓度范围目前仍不清楚，边缘供肝肝移植IRI仍是需要攻克的难题。不过，令人欣喜的是如鸢尾素、三氯化钆、SOD模拟物、ECMO技术等可减少边缘供肝肝移植过程中产生的ROS，对提高移植成功率可能会有帮助，有一定应用前景。