互叶白千层挥发油的化学成分及其抗肿瘤和抗虫生物活性

张坤，崔云峰

（1.天津市南开医院肝胆胰外科，天津 300100；2.天津医科大学研究生院）

挥发油是存在于植物体内的一类具有挥发性的油状液体，含有丰富的萜类和苯丙素类成分，具有广泛的生物活性，如抗氧化、杀虫、抗炎、镇痛和抗肿瘤等［1］。目前，挥发油在抗肿瘤药物研发和植物源农药领域具有良好的应用前景［1-3］。恶性肿瘤严重危害人类生命健康，其中，乳腺癌已成为全球女性最常见的恶性肿瘤之一［4］。恶性黑色素瘤恶性程度和致死率极高，生长快、易局部复发和远处转移，居皮肤恶性肿瘤之首［5-7］。挥发油及其活性成分对很多恶性肿瘤细胞增殖具有显著抑制作用，可有效延长或阻止肿瘤复发，具有治疗及辅助治疗的作用［2］。中药材仓储害虫防治一直是中药产业的薄弱环节，中药材经虫蛀后质地、功效发生变化，严重影响临床用药安全和疗效［8］。其中，赤拟谷盗Triboliumcastaneum（Herbst）为危害最为广泛的中药仓储害虫之一，除直接危害外，其臭腺分泌液含苯醌等致癌物质［9］。挥发油对害虫有很好的防治效果，对人畜毒性较低，不易产生抗药性，已经成为有效解决化学农药滥用的途径之一［9-10］。互叶白千层挥发油又称为茶树油（TTO），具有许多生物活性，如杀虫、抗菌、抗炎和抗肿瘤等，被广泛用于日化、食品及医药卫生方面［11-12］。本实验对挥发油的化学成分进行分析，并评价挥发油及主要成分的抗肿瘤和抗虫活性，以期寻找抗肿瘤及抗虫有效成分，为其开发应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 人乳腺癌细胞株MDA-MB-231购自湖南丰晖生物科技有限公司，小鼠黑色素瘤细胞株B16购自中国典型培养物保藏中心。互叶白千层挥发油购于天津中澳嘉喜诺生物科技有限公司，γ-松油烯、（-）-萜烯-4-醇、1，8-桉树脑和避蚊胺购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，阿霉素购自大连美仑生物技术有限公司，胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、DMEM和RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司，CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，青链霉素混合液（100×）双抗、DMSO购自北京索莱宝科技有限公司，正己烷（分析纯）购自天津津科精细化工研究所。

1.2 主要仪器 气相色谱-质谱（GC-MS）联用仪（日本Shimadzu公司），酶标仪（美国Bio Rad公司），CO2恒温恒湿培养箱（德国Binder公司），隔水式恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 GC-MS分析条件 互叶白千层挥发油的化学成分采用GC-MS法进行鉴定，色谱柱为Rtx-5Sil MS柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）。取1μl 1%的互叶白千层挥发油溶液注入GC-MS联用仪，不分流进样，采用程序升温，条件如下：最初温度设定为85℃，保持4 min，然后以10℃/min升温至200℃，最后以15℃/min升温至280℃，保持10 min。离子源温度230℃，进样口温度280℃，接口温度290℃，扫描质量范围80～600 m/z，离子化方式EI，载气为高纯氦气，载气流速1.0 ml/min。通过与NIST14.lib数据库比对鉴定互叶白千层挥发油的化学成分，通过峰面积归一化法确定各组分的相对百分含量。

1.3.2 细胞培养 MDA-MB-231细胞在DMEM培养基中培养，B16细胞在RPMI 1640培养基中培养。培养基中含10%的胎牛血清，100 U/ml的青霉素和0.1 mg/ml的链霉素。细胞在5%的CO2培养箱（37℃、90%湿度）中培养，待细胞汇合度达80%～90%后，使用0.25%胰蛋白酶消化后传代，每周传代2～3次。

1.3.3 体外抗肿瘤活性 参照文献［13］的方法，采用CCK-8法检测互叶白千层挥发油及其主要成分体外抗肿瘤活性。取对数生长期的MDA-MB-231和B16细胞接种于96孔板，置于5%的CO2培养箱（37℃、90%湿度）中培养12～24 h，使细胞贴壁。移除培养基后，加入含有样品的培养基溶液，每孔100μl，培养48 h，每组设5个重复孔，整个实验重复3次。然后，加入CCK-8试剂显色后，用酶标仪在450 nm波长处检测每孔的吸光度值。

1.3.4 供试昆虫 赤拟谷盗于2017年6月引种自北京师范大学资源学院。饲养条件：温度28～30℃，相对湿度为70%～80%的培养箱中饲养。饲料配制：将小麦磨成细粉，加入5%酵母粉，搅拌均匀。试虫传代：将配制好的饲料分装于0.5 L的广口瓶中，每瓶接种40～50头成虫，置培养箱中，14 d后筛出成虫，剩下含有虫卵的面粉放入培养箱中继续饲养，每周传代1次，筛选1～2周成虫作为供试昆虫。

1.3.5 熏蒸测试 依据文献方法［14］，对互叶白千层挥发油及其主要成分进行熏蒸活性测试。将10头试虫放入25 ml的螺口瓶中，然后用移液枪吸取10μl试药（试药用正己烷配制5个浓度梯度的试药，挥发油浓度：50%、33.33%、22.22%、14.81%和9.87%，（-）-萜烯-4-醇、γ-松油烯和1，8-桉树脑浓度：10%、6.67%、4.45%、2.97%和1.98%）滴于瓶盖内的滤纸片上，另取正己烷处理作为对照，待溶剂挥干后，拧紧瓶盖。每个浓度重复5次，整个实验重复3次。将实验组与对照组置于培养箱中培养24 h，观察和记录试虫的死亡情况。

1.3.6 触杀测试 依据文献方法［9］，对互叶白千层挥发油及其主要成分进行触杀活性测试。将供试昆虫置于冰袋上，待试虫不再移动，用移液枪吸取0.5μl试药（试药用正己烷配制5个浓度梯度的试药，挥发油、（-）-萜烯-4-醇和1，8-桉树脑浓度：30%、20%、13.33%、8.89%和5.92%，γ-松油烯浓度：8.75%、5.83%、3.89%、2.59%和1.73%）滴于试虫的前胸背板上，处理后放入25 ml的螺口瓶中，每瓶10头试虫，正己烷处理作为对照，每个浓度重复5次，整个实验重复3次。将实验组与对照组置于培养箱中培养24 h，观察和记录试虫的死亡情况。

1.3.7 驱避活性测试 依据文献方法［9］，对互叶白千层挥发油及其主要成分进行驱避活性测试。将直径为9 cm的圆形滤纸从中间剪成两半，用移液枪吸取500μl试药（5个浓度：78.63、15.73、3.15、0.63、0.13 nl/cm2）滴于其中一半滤纸上，另一半滴加正己烷作为对照，待溶剂挥干后，将滤纸黏贴在培养皿底部，把20头试虫均匀倒入培养皿中，每个浓度重复5次，整个实验重复3次。将实验组与对照组置于培养箱中，观察记录2、4 h时试虫在两边滤纸的分布数量，计算驱避率（PR）。Nc=对照部分虫数；Nt=给药部分虫数。

因为驱避活性有5个浓度，2个时间点，共10个PR，很难通过PR直接比较不同样品的驱避活性，所以引入“灰色关联度法”评价驱避活性［15］，通过相对关联度ri大小比较样品的驱避活性，ri值越大，驱避活性越显著，相对关联度ri的计算方法参照文献［16］。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0软件中的Probit analysis回归分析，计算半数抑制浓度（IC50）、半数致死浓度（LC50）和半数致死量（LD50）。采用SPSS 22.0软件中的ANOVA方差分析和Tukey检验，比较不同样本PR的显著性差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 互叶白千层挥发油的成分分析 所得到的GC-MS总离子流图见图1，挥发油成分分析见表1。由表1可知，从互叶白千层挥发油中检测出30种成分，主要成分为（-）-萜烯-4-醇（36.02%）、γ-松油烯（21.42%）、2-蒈烯（10.56%）、萜品油烯（3.34%）和1，8-桉树脑（3.17%）等。

图1 互叶白千层挥发油GC-MS总离子流图

表1 互叶白千层挥发油成分分析

续表1

2.2 互叶白千层挥发油及其主要成分的抗肿瘤活性 实验结果表明，互叶白千层挥发油及γ-松油烯对B16细胞的增殖具有显著的抑制作用，IC50分别为（12.02±1.46）和（17.47±5.38）μg/ml，而对MDA-MB-231细胞的增殖无显著的抑制作用，IC50均大于100μg/ml；（-）-萜烯-4-醇和1，8-桉树脑对MDA-MB-231和B16细胞的增殖无显著的抑制作用，IC50均大于100μg/ml；阳性对照阿霉素对MDA-MB-231和B16细胞的增殖均有显著的抑制作用，IC50分别为（2.02±0.65）和（0.51±0.01）μg/ml。

2.3 互叶白千层挥发油及其主要成分的熏蒸和触杀活性 熏蒸法和触杀法结果表明互叶白千层挥发油显示熏蒸（LC50=78.28 mg/L）和触杀活性（LD50=52.37μg/头），其主要成分1，8-桉树脑（LC50=12.30 mg/L）对赤拟谷盗的熏蒸活性最为显著，强于γ-松油烯（LC50=16.69 mg/L）和（-）-萜烯-4-醇（LC50=17.89 mg/L）。其主要成分γ-松油烯（LD50=167μg/头）对赤拟谷盗的触杀活性最为显著，强于1，8-桉树脑（LD50=38.12μg/头）和（-）-萜烯-4-醇（LD50=45.46μg/头）。见表2、3。

表2 互叶白千层挥发油及其主要成分对赤拟谷盗的熏蒸活性

表3 互叶白千层挥发油及其主要成分对赤拟谷盗的触杀活性

续表3

2.4 互叶白千层挥发油及其主要成分的驱避活性

在浓度为78.63和15.73 nl/cm2时，挥发油和（-）-萜烯-4-醇在2 h的PR最高，均在70%以上；而在浓度为3.15 nl/cm2时，挥发油和1，8-桉树脑在2 h的PR最高，分别为50%和36%；在浓度为0.63 nl/cm2时，挥发油和γ-松油烯在2 h的PR最高，分别为36%和16%；在浓度为0.13 nl/cm2时，挥发油和γ-松油烯在4 h的PR最高，分别为20%和10%。阳性对照避蚊胺，在低浓度0.13 nl/cm2时，PR在2 h和4 h均低于样品，分别为-28%和-62%，在其他4个浓度，PR在2 h和4 h均高于样品。见图2。

图2 互叶白千层挥发油及其主要成分对赤拟谷盗的驱避活性

由此可见，在不同的浓度和时间点，PR最高的样品会有不同，所以通过PR很难直观地评价哪个样品的整体驱避活性最好，因此，本文引入“灰色关联度法”评价驱避活性，互叶白千层挥发油驱避活性（ri=0.660 1）最为显著，与阳性对照避蚊胺接近（ri=0.650 0），其主要成分（-）-萜烯-4-醇（ri=0.423 0）的驱避活性要强于γ-松油烯（ri=0.372 0）和1，8-桉树脑（ri=0.369 1），见表4。

表4 互叶白千层挥发油及其主要成分驱避活性的相对关联度

3 讨论

本研究互叶白千层挥发油所含的主要成分为（-）-萜烯-4-醇（36.02%）、γ-松油烯（21.42%）、2-蒈烯（10.56%）、萜品油烯（3.34%）和1，8-桉树脑（3.17%）等。据报道，巴西圣塔玛丽亚产地的互叶白千层挥发油主要成分为萜烯-4-醇（34.6%）、γ-松油烯（20.3%）、α-松油烯（10.1%）和萜品油烯（4.2%）等［11］。广西南宁产地的互叶白千层花与叶挥发油的主成分为1，8-桉树脑（67.89%，68.14%）、α-松油醇（8.14%，10.59%）、柠檬烯（7.84%，8.54%）和α-蒎烯（3.18%，3.07%）等［18］。挥发油成分和含量的差异可能是由于地理位置、气候、采收时间、储存时间和提取方法的不同，这些变化可能会影响挥发油的生物活性［9，19］。

抗肿瘤活性结果表明，互叶白千层挥发油及γ-松油烯对B16细胞的增殖具有显著的抑制作用，IC50均小于13μg/ml，而对MDA-MB-231细胞的增殖无显著的抑制，IC50均大于100μg/ml，表明不同肿瘤细胞对同种物质的敏感程度是不同的。Qiu等［20］研究显示阿霉素共聚物胶束DOX/KC对人胃癌MGC80-3细胞增殖的抑制作用（IC50=0.50μg/ml）强于B16细胞（IC50=0.90μg/ml）、人乳腺癌MCF-7细胞（IC50=1.54μg/ml）和人肺腺癌A549细胞（IC50=2.21μg/ml），这与不同肿瘤细胞细胞核对药物的摄入速率相关，摄入速率越快对肿瘤细胞的毒性越大。此外，除互叶白千层挥发油和γ-松油烯外，挥发油中其他主要成分（-）-萜烯-4-醇和1，8-桉树脑对B16细胞的增殖无显著的抑制作用，IC50均大于100μg/ml，说明γ-松油烯可能为互叶白千层挥发油抗B16细胞的有效成分。因此，相同的肿瘤细胞对不同成分的敏感程度存在差异，这可能与不同成分的化学结构差异相关，通过比较γ-松油烯、（-）-萜烯-4-醇和1，8-桉树脑的化学结构和细胞毒性的关系发现，双键可能会增强单萜类成分的细胞毒性。文献也有对其他类型天然产物中双键增强细胞毒性的报道，例如，大环双联苄类成分中的双键可增强其对人宫颈癌Hela细胞、人慢性髓系白血病K562细胞、人结肠癌HT29细胞和人前列腺癌PC-3细胞增殖的抑制作用［21］。

抗虫活性结果表明，互叶白千层挥发油对赤拟谷盗显示熏蒸和触杀活性，虽然不如阳性对照甲基溴和除虫菊酯，但与其他一些运用相同生物测定方法的挥发油相比，互叶白千层挥发油对赤拟谷盗的毒性更大。例如，Ben Jemâa等［22］研究表明摩洛哥、阿尔及利亚和突尼斯月桂挥发油对赤拟谷盗熏蒸毒性的LC50分别为172.37、193.95和217.10μl/L，Liang等［23］研究表明灌木亚菊挥发油对赤拟谷盗触杀毒性的LD50为105.67μg/头。1，8-桉树脑、γ-松油烯和（-）-萜烯-4-醇对赤拟谷盗具有较好的熏蒸活性，LC50均小于18 mg/L。γ-松油烯对赤拟谷盗具有较好的触杀活性，LD50为17.67μg/头，而（-）-萜烯-4-醇和1，8-桉树脑的触杀活性不显著，LD50均大于38μg/头。由此可见，不同物质的抗虫活性存在差异，同种物质不同作用方式的抗虫活性强弱也不同。文献也有类似报道，Feng等［14］研究表明，艳山姜叶挥发油的主要成分莰烯的熏蒸活性最为显著（LC50=4.1 mg/L），而邻-异丙基苯的触杀活性最为显著（LD50=18.1μg/头）。此外，挥发油对赤拟谷盗的驱避活性最为显著，ri值为0.660 1；而其他成分对赤拟谷盗的驱避活性不显著，ri值均小于0.43。互叶白千层挥发油、（-）-萜烯-4-醇和1，8-桉树脑的驱避活性呈现浓度依赖性，随着浓度降低，PR减小。驱避作用一般可以分成3种模式，一种是高效型（在高浓度下活性显著，但随着浓度的下降活性急剧下降）；另一种是持久型（在所有测试浓度下都有中等和稳定的活性）；另一种是兼有两种类型的特点［14］。因此，互叶白千层挥发油属于持久型，在低浓度仍然显示驱避活性，而阳性对照避蚊胺属于高效性，在低浓度驱避活性急剧下降，甚至呈现吸引作用。

综上所述，本研究表明互叶白千层挥发油的主要成分为（-）-萜烯-4-醇、γ-松油烯、2-蒈烯、萜品油烯和1，8-桉树脑等；挥发油和γ-松油烯对B16细胞具有显著的抑制作用；1，8-桉树脑、γ-松油烯和（-）-萜烯-4-醇对赤拟谷盗有显著的熏蒸活性，γ-松油烯对赤拟谷盗有显著的触杀活性，挥发油对赤拟谷盗有显著的驱避活性。以上结果为研究和开发互叶白千层挥发油及其活性成分作为抗肿瘤天然药物和植物源农药提供理论基础，但其抗肿瘤和抗虫机制还需进一步研究。