NCBP2基因在人神经胶质瘤中的表达与调节细胞凋亡的机制研究

2022-12-03 06:53吴鹏薄威郭丽祁荣王一维
沈阳医学院学报 2022年6期
关键词:亚型胶质瘤试剂盒

吴鹏,薄威,郭丽,祁荣,王一维

(1.沈阳医学院基础医学院科学实验中心,辽宁 沈阳 110034;2.病理学教研室;3.人体解剖学教研室)

胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤,约占中枢神经系统(CNS)肿瘤的80%[1]。根据世界卫生组织(WHO)的CNS肿瘤分级,将胶质瘤分为Ⅰ~Ⅳ级。其中Ⅳ级胶质瘤最为常见并且侵袭性最强,又被称为胶质母细胞瘤(glioblastomas,GBM)[2]。尽管临床手术、放疗和传统化疗取得了进展,GBM的预后仍然很差,中位生存期为14~16个月。低级别胶质瘤(low-grade gliomas,LGG)(WHOⅡ级)患者,尽管生存期可能超过10年,但预后仍不理想,因为这些肿瘤最终将发展为高级别胶质瘤(high-grade gliomas,HGG)(WHOⅢ或Ⅳ级)[3]。核帽结合蛋白亚基2(nuclear cap binding protein subunit 2,NCBP2)也称为帽结合蛋白复合体2(cap-binding protein complex,CBC2)。有研究表明NCBP2以癌基因的表现存在于部分肿瘤之中,已被证实为卵巢癌的关键靶基因,并且在肺腺癌与肺鳞癌中表达上调[4]。NCBP2在人胶质瘤中表达情况鲜见报道,本研究拟探讨NCBP2基因在人胶质瘤中的表达及调节细胞凋亡的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人胶质瘤细胞U87(上海中国科学院细胞库);shRNA慢病毒质粒(上海GeneChem公司);Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒与TUNEL凋亡试剂盒(武汉伊莱瑞特生物公司);兔抗人NCBP2多克隆抗体与β-actin多克隆抗体(美国Abcam公司);Transwell小室(美国Corning公司);凋亡流式检测试剂盒(江苏凯基生物有限公司)。BD Accuri C6 Plus流式细胞仪(美国BD公司);ECLIPSE Ni-U光学显微镜(日本Nikon公司)。

1.2 方法

1.2.1NCBP2在泛癌中的表达水平和在HGG、LGG及其亚型中的表达 利用GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)基因表达谱交互式分析平台(http://gepia.cancer-pku.cn),分析NCBP2在泛癌中的表达水平和在HGG、LGG及其亚型中的表达情况。利用TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库获取胶质瘤LGG/GBM数据,分析NCBP2基因的表达差异并绘制受试者工作特征(ROC)曲线。

1.2.2 细胞培养与转染 将U87细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养,培养条件为5%CO237℃。在shRNA慢病毒质粒进行转染,并用嘌呤霉素进行筛选。

1.2.3 Western blot实验 刮取细胞,放入蛋白裂解液中2 h,提取总蛋白。用BCA试剂盒定量,测定浓度。样品(20μg蛋白)经10%分离胶电泳后,转膜。在用封闭液封闭1 h后,一抗孵育4℃过夜,二抗孵育37℃2 h,并通过ECL化学发光显影。

1.2.4 MTT实验 以3 000个细胞/孔的密度接种在6孔板中。在0、24、48和72 h时间点给予MTT溶液处理。孵育2 h后,将MTT溶液换成二甲基亚砜,在490 nm处测量每个孔的光密度。重复3次。

1.2.5 集落形成试验 将U87细胞接种在6孔板(500~1 000个细胞/孔)中培养13 d。细胞用4%多聚甲醛固定,结晶紫染色。平板成像、菌落计数和统计分析。重复3次。

1.2.6 Transwell实验 将U87细胞培养至对数生长期,用磷酸盐缓冲液和无血清培养基先后洗涤1次,用无血清培养基悬浮细胞,计数,调整浓度。在下室加入600~800μl含10%胎牛血清的培养基,上室加入100~150μl细胞悬液(上室铺胶为侵袭实验),培养24 h。取出小室,甲醇固定,加入Giemsa染液。用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞。显微镜下取9个随机视野计数,统计结果。重复3次。

1.2.7 TUNEL凋亡实验 在96孔板中接种细胞,待细胞贴壁后,培养24 h,用4%多聚甲醛室温下固定后,用磷酸盐缓冲液、蒸馏水洗涤。用TrionX-100通透,洗涤后加入平衡缓冲液、核苷混合物和重组末端脱氧核苷酸转移酶,37℃避光孵育2 h,洗涤后,加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚,荧光显微镜下观察。重复3次。

1.2.8 流式细胞术检测细胞凋亡 将U87细胞(1×105个细胞/孔)接种于6孔板中并培养细胞,转染后24 h;对照细胞为转染空载后24 h。然后收集细胞,用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒进行染色,随后用流式细胞仪检测细胞凋亡水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析,组间比较采用Mann-WhitneyU检验或One-way ANOVA检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1NCBP2在胶质瘤中的表达上调 GEPIA可视化平台分析了NCBP2在泛癌中的表达,结果发现NCBP2基因在LGG、GBM中表达显著高于正常脑组织,见图1A与B。提取TCGA的胶质瘤(689例)和GTEx中的正常组织(1 157例)数据,通过统计分析发现NCBP2基因在胶质瘤中表达上调,见图1C。ROC曲线发现,NCBP2 mRNA表达水平能准确区分肿瘤与非肿瘤组织样本,见图1D。

图1 NCBP2在胶质瘤中的表达上调

2.2NCBP2在胶质瘤亚型中的表达升高 利用GEPIA可视化平台分别比较LGG亚型中星形细胞瘤型(98例)、少星形细胞瘤型(76例)和少突胶质细胞瘤型(116例)与正常脑组织(207例)中NCBP2的表达,结果显示其在肿瘤组织中表达均升高,见图2A。分别比较GBM的亚型中经典型(40例)、间充质型(55例)、神经元型(28例)和前神经型(37例)与正常脑组织(207例)中NCBP2的表达,结果显示除神经元型外,NCBP2在其他亚型中表达均升高,见图2B。

图2 NCBP2在LGG亚型与GBM亚型中的表达

2.3 下调NCBP2基因抑制胶质瘤细胞的增殖能力为防止基因沉默的脱靶效应,我们设计了2个shRNA序列(shRNA#1、shRNA#2),通过Western blot法检测转染效率,显示这2组U87细胞中NCBP2的蛋白表达均降低,见图3A;MTT生长曲线发现沉默组U87细胞的增殖能力显著下调,见图3B;平板克隆形成实验结果显示沉默组U87细胞的克隆形成能力明显受到抑制,见图3C。

图3 沉默NCBP2基因抑制胶质瘤细胞增殖能力

2.4 下调NCBP2基因抑制胶质瘤细胞侵袭与迁移能力 Transwell侵袭与迁移实验结果显示,与shNC组比较,沉默NCBP2组(shRNA#1与shRNA#2)迁移与侵袭的细胞数量显著下调,见图4。

图4 沉默NCBP2基因抑制胶质瘤细胞侵袭与迁移能力

2.5 TUNEL染色检测细胞凋亡 TUNEL染色检测结果发现,shNC组细胞几乎不存在TUNEL阳性细胞,在沉默NCBP2基因组(shRNA#1与shRNA#2)中可以观察到高比例的凋亡阳性细胞,见图5。

图5 TUNEL染色检测细胞凋亡水平

2.6 流式细胞术检测细胞凋亡 流式凋亡实验检测结果发现,在人胶质瘤细胞U87中沉默NCBP2基因导致细胞凋亡率显著升高,见图6A和B;进一步通过Western blot结果显示NCBP2基因沉默组Cleaved-PARP与Cleaved-caspase 3蛋白表达上调而Bcl-2蛋白表达下调,见图6C。

图6 沉默NCBP2诱导胶质瘤细胞凋亡

3 讨论

胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤,其恶性程度高,预后差[5-6]。尽管有标准的治疗方案,包括手术后放疗和化疗,胶质瘤患者的预后仍然很差[7-8]。其中GBM是最具侵袭性的类型,肿瘤的异质性是GBM最重要的标志之一,导致治疗抵抗和肿瘤复发[9]。因此,想要有针对性地提高GBM患者的预后,应用个性化的治疗策略尤为关键。CBC是NCBP1和NCBP2组成的异二聚体复合物[10]。当NCBP2直接结合mRNA的帽状结构时,随后NCBP1可以招募mRNA成熟所需的细胞因子,这样保护了RNA聚合酶在转录过程中不被降解。CBC在mRNA从细胞核输出到细胞质、mRNA的剪接及成熟等多方面功能中起重要作用[11]。

在本研究中,为明确NCBP2基因在胶质瘤中的表达,我们首先使用GEPIA可视化平台分析发现NCBP2在LGG与GBM中表达上调。为进一步证实该基因在胶质瘤中的表达差异及临床意义,我们从公开的TCGA数据库中下载了689例样本的基因表达信息及临床资料、GTEx数据库中1 157例正常样本,通过统计分析显示NCBP2基因在胶质瘤中表达上调;更值得关注的是ROC分析发现NCBP2是胶质瘤诊断的潜在生物学标志物。在果蝇的研究中发现,NCBP2的同源基因被敲除后能够破坏神经细胞的增殖能力[10]。我们应用基因沉默技术,在人胶质瘤细胞U87中下调NCBP2基因,并通过Western blot检测转染效率,应用MTT实验、克隆形成实验与Transwell侵袭与迁移发现沉默NCBP2基因抑制人胶质瘤细胞增殖、侵袭与迁移能力。

细胞凋亡是一种细胞程序性死亡的过程,其特征是染色质浓缩、核碎裂、凋亡小体的形成、ROS水平的增加和caspases的激活,死亡受体途径(外源性途径)和线粒体凋亡途径(内源性途径)是导致细胞凋亡的2条主要途径[12]。本研究发现,沉默NCBP2基因能够促进人胶质瘤细胞的凋亡。Bcl-2是一种重要的癌基因,在细胞凋亡中起重要作用。Bcl-2蛋白家族主要调控细胞[13]。我们应用Annexin V-FITC和PI双染色,通过流式细胞术检测细胞凋亡情况,NCBP2基因表达下调组U87细胞凋亡率明显上升,同时通过Western blot法结果显示沉默NCBP2组细胞Cleaved-PARP与Cleavedcaspases 3蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达下调。

综上所述,本研究首次通过生物信息学,利用多种数据库及可视化平台分析了人类胶质瘤中NCBP2的表达情况,及该基因在胶质瘤中表达的重要意义。并且通过实验验证,沉默NCBP2基因后可以抑制人胶质瘤细胞U87的恶性生物学进程,并且诱导细胞的凋亡。

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