B族维生素上调KDM5家族减轻PM2.5诱发孕鼠抑郁样行为的作用及机制*

黄嘉，刘冲，佘瑛洁，刘欣琪，刘永萍，张天亮，于丽△

（1潍坊医学院基础医学院，山东 潍坊 261053；2潍坊医学院临床医学院，山东 潍坊 261053；3潍坊医学院医学研究实验中心，山东 潍坊 261053）

大气颗粒物（particulate matter，PM）是衡量大气污染的重要标准，根据世界卫生组织估计，目前世界上90%以上的人口依然生活在超出标准的污染地区。PM2.5（环境中空气动力学直径≤2.5µm的颗粒物）因其特殊的结构和理化性质，因而其表面易携带大量有害元素和有毒有机物。暴露于PM2.5会引起包括氧化应激、炎症、DNA损伤和内质网应激在内的多种机制改变，造成机体损伤［1-3］。居民生活在空气污染较严重的区域出现精神疾病症状的风险更高，而空气污染对孕妇的精神状况影响尤为明显。孕妇属于非常脆弱的群体，整个妊娠期都处于情绪特别不稳定的状态，是抑郁症发生的潜在风险人群［4］。最新研究发现，PM2.5可以通过血液从肺部到达大脑，而脑内颗粒物的清除相较于机体其他器官更慢、更困难，脑内的颗粒物可以对脑组织及其周围细胞带来更持久的毒性作用［5］。据文献统计，环境中PM2.5每增加10µg/m3就会增加5.1%认知功能不良的风险；PM2.5暴露量增加1µg/m³会导致认知反应时间延长2%［6-7］；妊娠期间母亲PM2.5暴露量在16.4～29.3µg/m3将会增加83%的产后抑郁风险［8］。本课题组前期研究也发现，妊娠期暴露于高浓度PM2.5环境会导致孕鼠中枢性系统炎症反应增强，B族维生素（B vitarnins，VitB）干预可以在一定程度抑制大脑皮层炎症通路的激活［9-10］。但环境污染导致孕妇精神变化的确切机制尚不清晰。

环境损伤和遗传因素均可导致个体的认知和情绪问题，而表观遗传则可能是两者的中介［11-12］。文献表明，组蛋白去甲基化酶KDM5家族成员在精神疾病和认知障碍中表达下降，KDM5家族调控组蛋白H3第4位赖氨酸（histone H3 lysine 4，H3K4）的去甲基化，而H3K4则与认知和精神疾病高度相关［13］。因此，我们拟进一步探究KDM5家族在B族维生素干预PM2.5致孕鼠抑郁样行为中的表达变化，并从表观遗传学角度探讨B族维生素改善PM2.5诱发孕鼠抑郁样行为的作用机制。

材料和方法

1 材料

1.1 实验动物SPF级ICR小鼠，8～9周龄，体重（28±2）g，购于山东省济南实验动物中心，许可证号为SCXK（鲁）2019-0003。运输至实验环境后适应1周。饲养条件：自由饮水进食，室温25℃左右。将雌雄小鼠按2∶1的比例合笼，次日雌鼠查出阴栓者即为妊娠第1天。

1.2 主要材料与试剂维生素B6、维生素B12和叶酸均购自Sigma；BCA蛋白浓度测定试剂盒、PCR Master Mix、蛋白预染Marker和ECL发光试剂盒均购自Thermo Scientific；Hoechst、PMSF和RIPA裂解液均购自Solarbio；Trizol购自Invitrogen；SYBR Premix Ex Taq购自TaKaRa；兔KDM5A、KDM5B、KDM5C、H3K4me3和突触小泡蛋白（synaptophysin，SYP）单克隆抗体，兔生长相关蛋白43（growth-associated protein-43，GAP-43）多克隆抗体，鼠神经元核抗原（neuronal nuclear antigen，NeuN）和β-actin单克隆抗体均购自Abcam；兔突触后致密蛋白95（postsynaptic density protein 95，PSD95）单克隆抗体购自Cell Signaling Technology；HRP标记的羊抗小鼠IgG和HRP标记的羊抗兔IgG均购自Proteintech；KDM5A、KDM5B、KDM5C及β-actin的引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCR

1.3 主要仪器SMARTV 3.0小动物行为学视频采集与分析系统（Panlab）；NanoDrop 2000c核蛋白分析仪（Thermo）；基因扩增仪ProFlex PCR型（Life Technologies）；CFX96荧光定量PCR仪（Bio-Rad）；肺部液体定量雾化器（北京慧荣和科技有限公司）。

2 主要方法

2.1 PM2.5悬液的制备使用大气颗粒物采样器，收集2019年12月～2020年1月采暖季某地级市城区大气PM2.5。将颗粒物过滤膜切成小块，在低温下用去离子水处理。超声波振荡4次（每次30 min）。然后收集洗脱液并在真空中冷冻干燥，将冷冻干燥的粉末保存在-20℃。以PBS为溶剂配成悬浊液，按照冬季地区PM2.5最高值1 000µg/m3，转换为小鼠体重则为20.736µg/kg。

2.2 PM2.5暴露模型的制备与分组 查出阴栓后，将共计39只的孕鼠随机分为对照（control）组、PM2.5组和PM2.5+VitB组，查出阴栓的当天记为E0。PM2.5暴露组：采用负压喷雾装置，使用气管雾化的方式给予PM2.5暴露，每3 d一次（即E0.5、E3.5、E6.5、E9.5、E12.5和E15.5），每 次50µL PM2.5混悬液，整个孕期共6次；对照组：气管雾化给予等量0.01 mol/L PBS；B族维生素干预组：气管雾化给予相同剂量的PM2.5混悬液，30 min后进行B组维生素（叶酸0.6 mg·kg-1·d-1，维生素B6 11.4 mg·kg-1·d-1，维生素B12 0.2 mg·kg-1·d-1）灌胃，B族维生素混合液的制备参考文献中的数据将人的剂量等效换算为小鼠［14］，从妊娠期第1天开始每天进行灌胃（E0.5～E17.5）。妊娠结束后的第14天，孕鼠进行行为学测试；分离其大脑皮层，分别用于分子生物学检测、免疫荧光染色和高尔基染色，相关流程见图1。

Figure 1.Schedule of treatment and behavioral tests in mice models.图1 孕鼠模型建立和相关实验时间表

2.3 旷场实验（open-field test，OFT）孕鼠妊娠结束后的第14天进行旷场实验，将其置于实验箱（40 cm×40 cm×35 cm）的中心位置，然后使用Smart V3.0智能视频跟踪系统记录母鼠5 min内的探索轨迹和行为学参数，包括总运动距离及在中心区域（20 cm×20 cm）的移动距离和时间。

2.4 RT-qPCR实验大脑皮层匀浆，Trizol试剂提取总RNA并逆转录。使用第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA。在CFX-manager 3.1系统上，使用SYBR预混料Ex TaqⅡ试剂盒进行RT-qPCR实验。采用2-ΔΔCt法测定mRNA的变化，β-actin为内参照，KDM5A、KDM5B和KDM5C的逆转录和扩增反应参考之前的程序进行［15］，各引物序列详见表1。

2.5 Western blot大脑皮层组织加入RIPA裂解液提取蛋白质，BCA试剂盒进行蛋白定量，行10%SDSPAGE。300 mA恒流转至PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭2 h，Ⅰ抗孵育4℃过夜：兔源KDM5A单克隆抗体（1∶5 000），兔源KDM5B单克隆抗体（1∶1 000），兔源KDM5C单克隆抗体（1∶1 000），兔源H3K4单克隆抗体（1∶1 000），兔源SYP单克隆抗体（1∶20 000），兔源PSD95单克隆抗体（1∶1 000），兔源GAP-43多克隆抗体（1∶1 000）。TBST洗涤10 min×3次，分别加入HRP标记的羊抗兔IgG（1∶2 000），室温孵育2 h。TBST洗涤10 min×3次。最后加入ECL发光液曝光、拍照。ImageJ凝胶分析工具定量分析条带灰度。

2.6 免疫荧光双标染色制备大脑皮层10µm冰冻切片，PBS洗片5 min×3次，微波抗原修复，10%羊血清37℃封闭1 h，加入Ⅰ抗4℃孵育过夜：兔源KDM5A单克隆抗体（1∶500），兔源KDM5B单克隆抗体（1∶150），兔源KDM5C单克隆抗体（1：150），鼠源NeuN单克隆抗体（1∶200）。根据Ⅰ抗种属分别滴加Cy3标记的羊抗兔IgG（1∶200）或Alexa Fluor 488标记的羊抗鼠IgG（1∶200），37℃避光孵育1 h，Hoechst染核，37℃孵育25 min，封片观察。

2.7高尔基染色孕鼠用5%的水合氯醛麻醉，完整剥离鼠脑，制备100µm大脑皮层冰冻切片，按照FD Rapid GolgiStain™Kit快速高尔基染色试剂盒说明书进行高尔基染色，按照说明书进行后续操作，封片。暗处晾干后观察。

3 统计学处理

应用SPSS 25.0软件将测出的数据进行统计学分析，实验结果用均数±标准差（mean±SD）表示。多样本组间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 B族维生素干预可减轻PM2.5导致的孕鼠抑郁样行为

如图2所示，与正常对照组相比，PM2.5暴露后的孕鼠总活动距离显著减少（P＜0.01），进入旷场中央区的时间（P＜0.05）与距离（P＜0.01）显著减少；而与PM2.5暴露组相比，B族维生素干预组孕鼠总活动距离显著增加（P＜0.01），在中央区活动的距离和时间亦显著增加（P＜0.05）。由此提示，B组维生素同步干预可以明显减轻孕期PM2.5暴露导致的孕鼠抑郁样行为。

2 B族维生素干预可缓解PM2.5导致的孕鼠大脑皮层神经元损伤

NeuN免疫荧光染色显示，与对照组相比，孕期暴露于PM2.5的孕鼠大脑皮层神经元的细胞核出现形状不规则或破裂，神经元排布散乱、间隙较大，NeuN阳性细胞数量减少，染色较浅；而经过B族维生素干预后神经元细胞核形状规则，形态有所改善，神经元排布较为整齐，NeuN阳性细胞分布和数量与对照组基本一致，提示B族维生素可以保护母体神经细胞，见图3A。

高尔基染色结果显示，相较于对照组，孕期暴露于PM2.5的孕鼠大脑皮层椎体神经元数量和树突分支数量降低，神经元树突形态的复杂性下降，且星形神经元向大脑皮层的外颗粒层分布；而经过B族维生素干预后，大脑皮层椎体神经元数量增多，树突分支数得到一定恢复，树突形态的复杂性也得到了一定保护，且星形神经元分布恢复正常，见图3B。这说明孕期给予B族维生素干预可以在一定程度上保护神经元，避免PM2.5对孕鼠神经元造成的损伤。

3 B族维生素干预可减轻PM2.5暴露导致的大脑皮层突触损伤

Western blot结果显示，与对照组相比，孕期暴露于PM2.5的孕鼠大脑皮层轴突生长相关蛋白GAP-43蛋白表达水平下调，SYP和突触后致密蛋白PSD95蛋白表达水平显著下降（P＜0.05或P＜0.01）；与PM2.5暴露组相比，B族维生素干预组大脑皮层GAP-43表达水平上调，SYP和PSD95表达水平显著上升（P＜0.05或P＜0.01），见图4。这说明孕期给予B族维生素干预可以在一定程度上保护突触可塑性，避免PM2.5对孕鼠的突触可塑性造成损伤。

Figure 3.Immunofluorescent staining of NeuN（A）and Golgi staining（B）in cerebral cortex of pregnant mice in each group.The scale bar=50µm.图3 各组孕鼠大脑皮层NeuN免疫荧光染色和高尔基染色

4 B族维生素干预可上调孕鼠大脑皮层KDM5家族的mRNA水平

RT-qPCR结果显示，孕鼠暴露于PM2.5后，大脑皮层KDM5A、KDM5B和KDM5C的mRNA表达水平显著低于对照组（P＜0.05或P＜0.01）；而与PM2.5暴露组相比，B族维生素干预组孕鼠大脑皮层KDM5A、KDM5B和KDM5C的mRNA表达水平也显著上升（P＜0.05或P＜0.01），见图5。这说明孕期给予B族维生素干预可以在mRNA水平上调KDM5家族的表达。

5 B族维生素干预可提高孕鼠大脑皮层KDM5家族蛋白水平，降低H3K4me3表达

与对照组相比，孕期暴露于PM2.5的孕鼠大脑皮层KDM5A、KDM5B和KDM5C的蛋白表达水平显著下降（P＜0.05），H3K4me3表达水平则上升（P＜0.05），说明PM2.5可以引起孕鼠大脑皮层组蛋白甲基化水平升高；与PM2.5暴露组相比，B族维生素干预组大脑皮层KDM5A、KDM5B和KDM5C的表达水平上调（P＜0.05），而H3K4me3的蛋白表达水平降低（P＜0.05），见图6。这说明孕期给予B族维生素可以上调KDM5家族蛋白的表达，在一定程度上减轻PM2.5导致的甲基化水平异常。

6 B族维生素干预可上调孕鼠大脑皮层神经元KDM5蛋白表达

免疫荧光双标染色显示，KDM5A、KDM5B和KDM5C荧光染色均主要表达在大脑皮层神经元；相较于对照组，孕期暴露于PM2.5的孕鼠大脑皮层KDM5A+/NeuN+、KDM5B+/NeuN+和KDM5C+/NeuN+双阳性神经元数量均明显减少；而B族维生素同步干预 后，KDM5A+/NeuN+、KDM5B+/NeuN+和KDM5C+/NeuN+双阳性神经元数量增多，见图7。这说明孕期B族维生素干预可通过上调神经元中KDM5蛋白的表达，缓解PM2.5暴露对神经元造成的损伤。

Figure 4.The protein expression of SYP，GAP-43 and PSD95 in cerebral cortex of pregnant mice in each group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs PM2.5 group.图4 各组孕鼠大脑皮层中突触相关蛋白的表达情况

Figure 5.Relative mRNA expression of KDM5 family in cerebral cortex of pregnant mice in each group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs PM2.5 group.图5 各组孕鼠大脑皮层中KDM5家族的mRNA表达情况

讨 论

细颗粒物是一种能对全球公共健康造成巨大危害的城市空气污染物。越来越多的证据表明，暴露于PM2.5会损伤脑等重要器官，造成不可逆转的严重损害［1-3，5］。最新研究表明，PM2.5暴露与包括抑郁症在内的精神疾病的发生存在关联，生活在PM2.5暴露地区会出现焦虑，甚至自杀等严重后果［4］。孕妇在妊娠期孕育新生命的同时也经历着巨大的心理变化，易产生抑郁、焦虑等心理问题。对于孕期环境暴露的研究主要关注于子代的发育［12，16］，在空气污染和妊娠的双重压力下观察并探讨孕妇的精神健康并寻找相应的保护治疗机制迫在眉睫。组蛋白H3K4甲基化状态作为一种与神经疾病密切相关的表观遗传修饰，其失衡不仅会影响机体的精神状态，而且其去甲基化酶KDM5家族的表达也影响着机体的精神状态［17］。KDM5家族由KDM5A、KDM5B、KDM5C和KDM5D组成，前3个成员与智力障碍、自闭症谱系障碍和精神分裂症等多种神经疾病密切相关［18-19］。由此我们推测，PM2.5与妊娠双重压力下造成的孕鼠精神状态的改变可能与KDM5家族有关。

本课题组前期研究发现，妊娠期大气细颗粒物暴露会导致孕鼠出现神经系统损伤［10］。有研究发现，组蛋白H3K4的甲基化修饰与神经系统损伤密切相关［17］。进一步探究颗粒物暴露致孕鼠组蛋白修饰的变化，我们检测发现PM2.5可导致孕鼠产后大脑皮层组蛋白H3K4me3的表达水平升高，其相关的组蛋白去甲基化酶KDM5A、KDM5B和KDM5C表达均下调。说明妊娠期暴露于PM2.5会导致孕鼠组蛋白H3K4甲基化状态增强，从而抑制基因表达。而研究发现患有神经疾病，诸如ARID、ID/ASD和MRXSCJ的个体KDM5家族的表达降低［13］，与上述结果一致。研究报道，KDM5A和KDM5C作为关键调控基因在ASD发病中表达水平降低［18-19］。我们之前的研究发现，孕期PM2.5会暴露会导致子代鼠出现自闭样行为［20］。研究报道，某些表观遗传同样存在跨带遗传现象［13］。因此，我们推测孕期暴露于PM2.5会导致孕鼠表观遗传发生改变，继而通过表观遗传的跨代遗传导致子鼠出现自闭症。但这需要进一步的研究证实。

Figure 6.Relative protein epression of KDM5 family and H3K4me3 in cerebral cortex of pregnant mice in each group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs PM2.5 group.图6 各组孕鼠大脑皮层KDM5家族及H3K4me3的蛋白表达情况

最新研究报道，机体可以通过补充维生素B来挽救因暴露于PM2.5环境而导致的DNA甲基化异常［20］，但是否可以预防PM2.5暴露所致的组蛋白甲基化异常，目前尚不明确。B族维生素具有抗炎、抗氧化的特性和免疫表观遗传效应［21-22］，由此我们推测B族维生素可能对空气污染引起的疾病也有一定的保护作用。本研究建立了妊娠期B族维生素干预PM2.5损伤动物模型，发现孕鼠孕期给予一定的B族维生素干预后，大脑皮层中KDM5A、KDM5B和KDM5C的表达下降可以被挽救，H3K4的甲基化水平趋于正常。这说明B族维生素可以通过调节KDM5家族的表达一定程度上逆转PM2.5所致的H3K4甲基化异常。近期研究表明，抑郁症与突触可塑性的改变关系密切［23］，我们推测PM2.5暴露调控组蛋白修饰变化导致的孕鼠抑郁样行为可能与突触可塑性有关，因此我们进一步研究了突触相关蛋白的改变。突触相关蛋白SYP是一种存在于神经末梢的突触前囊泡蛋白，与突触功能密切相关，是突触前成分的标志物，与突触可塑性关系密切；轴突膜蛋白GAP-43是一种神经特异性的蛋白质，主要参与神经细胞外生长及突触发育形成和神经细胞再生；PSD95是突触后密度中丰富的支架蛋白是突触后成分的标志物，可促进突触形成，在突触可塑性中起重要作用［24］。在B族维生素干预后，突触相关蛋白GAP-43、SYP和PSD95的下降可以被挽救，神经元的数量与形态也趋于正常，说明B族维生素可以在一定程度上保护母体的突触可塑性，维持神经元正常的功能形态。

Figure 7.Immunofluorescence double staining of KDM5（red）and NeuN（green）in the cerebral cortex of pregnant mice in each group.Blue：nuclei stained by Hoechst.The scale bar=50µm.图7 各组孕鼠大脑皮层KDM5/NeuN免疫荧光双标染色结果

综上所述，孕期给予B族维生素同步干预可通过上调大脑皮层KDM5的转录和翻译水平，纠正组蛋白甲基化异常，减轻PM2.5造成的神经元损伤，从而缓解孕鼠抑郁样行为。