CypA/CD147及MMP-2在人慢性牙周炎牙龈组织中CD68+细胞上表达的研究*

余施雷，李娟，杨婷，黄世光△

（1杭州牙科医院，浙江 杭州 310000；2暨南大学口腔医学院，广东 广州 510632）

牙周炎（periodontitis）是牙周病（periodontal diseases）的主要疾病类型之一，这是一种缓慢进展的发生在牙周软硬组织上的炎症性破坏性疾病，最终结局是牙齿病理性松动脱落，丧失咀嚼功能。CD68是单核/巨噬细胞的可靠标记，研究报道在慢性牙周炎中观察到CD68+细胞的表达均较单纯牙龈炎患者增多；而侵袭性牙周炎组织中其表达量又多于慢性牙周炎组织［1-3］。

亲环素A（cyclophilin A，CypA）是由单核/巨噬细胞、活化血小板及内皮细胞等分泌的促炎细胞因子，可促进各种细胞类型的炎症反应［1，4］；还可促进白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6及肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等分泌，加重炎症反应［5］。目前研究显示，CypA可在慢性牙周炎患者牙龈组织、龈沟液（gingival crevicular fluid，GCF）及唾液中检测到，且其表达水平高于健康牙龈组织［6］。CD147是免疫球蛋白家族的一员，能够在单核/巨噬细胞表面表达，并且可作为CypA的表面受体［7］。研究者在人健康及炎症牙龈组织、GCF及唾液中检测到CD147存在，但其表达水平在炎症组织中较高［8］。基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）由成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和T细胞等生成，可降解明胶和IV，V，IX型等胶原纤维，其过量表达能够促进疾病中细胞外基质的降解，在牙周软硬组织破坏中起到关键作用［9-10］。

目前CypA/CD147对MMP-2的调控作用及三者在人慢性牙周炎CD68+细胞上的表达及临床意义尚未阐明，我们推测CypA与CD147相互作用产生的结果可能是促进体外MMP-2含量增多，通过促使破骨细胞行使破坏功能、加重临床症状如牙槽骨破坏等来参与人牙周炎病变的发展。本研究通过观察CypA、CD147及MMP-2在CD68+细胞的表达情况，探讨CD68+细胞CypA、CD147及MMP-2在不同程度牙周炎组织中的作用及作用机制。

材料和方法

1 实验材料

Mouse CD68抗体（M0814，Dako Denmark A/S）；抗CypA抗体（bs-5912R，北京博奥森生物公司）；抗CD147抗体（bs-0684R，北京博奥森生物公司）；抗MMP-2抗体（bs-4599R，北京博奥森生物公司）；CY3（山羊抗鼠）（GB21301，武汉赛维尔生物科技有限公司）；FITC（山羊抗兔）（GB22303，武汉赛维尔生物科技有限公司）；DAPI（G1012，武汉赛维尔生物科技有限公司）；BSA（G5001，武汉赛维尔生物科技有限公司）；Ⅱ抗试剂盒（Dako Denmark A/S）；DAB显色试剂盒（ZLI-9019，北京中杉金桥生物技术有限公司）。普通光学显微镜（Leica）；荧光显微镜和成像系统（Nikon）。

2 方法

2.1 病例选择选择2019年7月～2020年6月就诊于暨南大学附属第一医院及中山市人民医院口腔科且自愿接受本研究的60例患者（年龄16～68岁）纳入本实验，其中男32例，平均年龄（37±14）岁；女28例，平均年龄（35±15）岁。根据Armitage等［11］牙周病分类指南为标准，评定分组项目的检查均由同一名医生完成，检查包括牙龈指数（gingival index，GI）、探诊深度（probing depth，PD）和附着丧失（attachment loss，AL），影像学观察牙槽骨吸收程度。按要求分为4组，每组15例。每组患者年龄、性别差异无意义（P＞0.05）。所有选取女性患者均否认怀孕、服用长效或短效避孕药病史，少数患者或患有心血管或其他系统性疾病，并且至少三个月内未服用抗生素治疗。研究方案经暨南大学附属第一医院及中山市人民医院伦理委员会批准同意。告知每位患者实验内容并签署知情同意书。在进行牙周治疗前，获取牙龈组织标本。

2.2 实验分组健康对照组（15例）：牙周健康的正畸牙或智齿。GI=0，PD≤3 mm，AL=0，X线观察牙槽骨无明显吸收。

轻度慢性牙周炎组（15例）：种植手术拔除的需行冠延长术或牙周翻瓣术的患牙。GI=1，PD≤4 mm，AL=1～2 mm，X线观察牙槽骨吸收小于根长1/3。

中度慢性牙周炎组（15例）：需行牙周手术采用内斜切口患牙。GI=2～3，PD=（4～6）mm，AL=（3～5）mm，X线观察牙槽骨吸收1/3≤根长＜1/2。

重度慢性牙周炎组（15例）：无法保留或预后差的需拔除的患牙。GI=3，PD＞6 mm，AL≥5 mm，X线观察牙槽骨吸收1/2≤根长＜2/3。

2.3 组织标本采集、处理牙龈组织标本置于10%中性福尔马林固定液中浸泡24～48 h，制作5µm厚度的连续切片。HE染色后的由两名病理医师在光镜下盲法观察组织学表达情况后评分，参照Huang等［12］牙龈炎症程度评分标准（0～3分），取两人评分均值。

2.4 CD68-CypA、CD68-CD147及CD68-MMP-2双阳性细胞免疫荧光双染色CD68阳性信号在胞质及胞膜呈现红光，CypA、CD147以及MMP-2阳性信号在胞质及胞膜呈现绿光，DAPI核染紫外激发为蓝色，同一视野下CD68-CypA、CD68-CD147以及CD68-MMP-2阳性重叠后呈见黄光。切片于400倍镜下随机选取5个视野（0.0768 mm2/视野），对每个视野DAPI阳性及表达CD68-CypA、CD68-CD147或CD68-MMP-2双阳性细胞进行计数取均值，根据所测面积计算单位面积双阳性细胞密度（cells/mm2）。

3 统计学处理

采用SPSS 25.0 Statistics进行统计分析，数据表示为均数±标准差（mean±SD），设α=0.05为检验水准。

（1）牙龈评分数据选择多独立样本比较（Kruskal-WallisH检验）分析各组评分是否存在差异性；当P＜0.05时，再对4个组别样本进行两两比较检验各个组别间的差异性。

（2）4组标本的CD68-CypA、CD68-CD147、CD68-MMP-2双阳性细胞密度样本均数间差别的比较采用One-way ANOVA（本实验数据采用Levene法检验后显示方差不齐，选取Tamahane"s T2法）。

（3）采用Pearson分析各组CD68-CypA、CD68-CD147、CD68-MMP-2双阳性细胞密度与慢性牙周炎炎症程度评分间关系。

（4）采用Pearson分析各组CD68-CypA、CD68-CD147双阳性细胞密度与CD68-MMP2双阳性细胞密度间关系。

结 果

1 各组HE染色结果

健康组：结构无明显异常，多为胶原纤维分布，上皮及固有层内未观察到明显炎症细胞浸润。轻度组：沟内上皮下方少量炎症细胞浸润，胶原纤维变性。中度组：沟内上皮下方炎症细胞浸润多于轻度，浆细胞增多，纤维结缔组织增生，胶原纤维变性。重度组：上皮钉突伸长至结缔组织，见大量炎症细胞浸润，淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞散在分布，胶原纤维水解变性（见图1A）。

各组炎症评分比较见图1B、C，统计分析显示：与健康组的牙龈组织炎症程度评分相比，慢性牙周炎组牙龈组织的评分显著升高（P=0.000）；不同炎症程度牙周炎组间的评分亦存在显著差异（P＜0.01），评分随炎症程度加重而增加。

Figure 1.Histology of human tissues in the 4 groups.A：HE staining（scale bars=50µm），collagen fibers were mostly distributed in healthy group and inflammatory cell gradually increased in periodontitis groups；B：inflammation score distribution；C：comparison of inflammation score.Mean±SD.n=15.**P＜0.01 vs healthy group；##P＜0.01 vs slight group；△△P＜0.01 vs moderate group.图1 各组病理学结果

2 CD68-CypA DIF染色结果

各组标本组织中CD68-CypA双阳性细胞染色结果见图2A。健康组中CD68-CypA双阳性细胞几乎无表达，细胞上特异性黄色重叠荧光几乎未观察到；轻度组中CD68-CypA双阳性表达细胞数量稍有增加，见少量细胞上有特异性黄色重叠荧光表达；中度组中存在许多CD68-CypA双阳性细胞，见较多细胞上有特异性黄色重叠荧光表达；重度组中见大量CD68-CypA双阳性细胞，大量细胞上有特异性黄色重叠荧光表达。

计算CD68-CypA双阳性细胞密度后各组间比较（见图2B、C），统计分析结果显示：CD68-CypA双阳性细胞密度在健康组及各组牙周炎牙龈组织中存在显著差异（F=308.892，P＜0.01），各个组别间比较结果为：轻度组的双阳性细胞密度高于健康组（P＜0.01），中度高于轻度组（P＜0.01），重度高于轻、中度组（P＜0.01）。

Figure 2.The relevant data of CD68-CypA double-positive cells.A：DIF staining（scale bars=50µm），almost no expression of double-positive cells in healthy group and the double-positive cells gradually increased in periodontitis groups；B：CD68-CypA double-positive cell density distribution；C：analyze of CD68-CypA double-positive cell density expression.Mean±SD.n=15.**P＜0.01 vs healthy group；##P＜0.01 vs slight group；△△P＜0.01 vs moderate group.图2 CD68-CypA DIF染色结果

3 CD68-CD147 DIF染色结果

各组标本组织中CD68-CD147双阳性细胞染色结果见图3A。健康组中CD68-CD147双阳性细胞几乎无表达，细胞上特异性黄色重叠荧光几乎未观察到；轻度组中CD68-CD147双阳性表达细胞数量稍有增加，见少量细胞上有特异性黄色重叠荧光；中度组中存在许多CD68-CD147双阳性细胞，见较多细胞上特异性黄色重叠荧光表达；重度组中存在大量CD68-CD147双阳性细胞，大量细胞上有特异性黄色重叠荧光表达。

计算CD68-CD147双阳性细胞密度后各组间比较（见图3B、C），统计分析结果显示：CD68-CD147双阳性细胞密度在健康组及各组牙周炎牙龈组织中存在显著差异（F=403.264，P＜0.01），各个组间比较结果为：轻度组的双阳性细胞密度高于健康组（P＜0.01）；中度高于轻度组（P＜0.01）；重度高于轻、中度组（P＜0.01）。

Figure 3.The relevant data of CD68-CD147 double-positive cells.A：DIF staining（scale bars=50µm），almost no expression of double-positive cells in healthy group and the double-positive cells gradually increased in periodontitis groups；B：CD68-CD147 double-positive cell density distribution；C：analyze of CD68-CD147 double-positive cell density expression.Mean±SD.n=15.**P＜0.01 vs healthy group；##P＜0.01 vs slight group；△△P＜0.01 vs moderate group.图3 CD68-CD147 DIF染色结果

4 CD68-MMP-2 DIF染色结果

各组标本组织中CD68-MMP-2双阳性细胞染色结果见图4A。健康组中CD68-MMP-2双阳性细胞少几乎无表达，特异性黄色荧光几乎未观察到；轻度组中CD68-MMP-2双阳性表达细胞数量稍有增加，见少量细胞上有特异性黄色重叠荧光表达；中度组中存在许多CD68-MMP-2双阳性细胞，见较多细胞上有特异性黄色重叠荧光阳性表达；重度组中存在大量CD68-MMP-2双阳性细胞，大量细胞上有特异性黄色重叠荧光表达。

计算CD68-MMP-2双阳性细胞密度后各组间比较（见图4B、C），统计分析结果显示：CD68-MMP-2双阳性细胞密度在健康组及各组牙周炎牙龈组织中存在显著差异（F=254.419，P＜0.01），各个组间比较结果为：轻度组双阳性细胞密度高于健康组（P＜0.01）；中度高于轻度组（P＜0.01）；重度高于轻、中度组（P＜0.01）。

Figure 4.The relevant data of CD68-MMP-2 double-positive cells.A：DIF staining（scale bars=50µm），almost no expression of double-positive cells in healthy group and the double-positive cells gradually increased in periodontitis groups；B：CD68-MMP-2 double-positive cell density distribution；C：analyze of CD68-MMP-2 double-positive cell density expression.Mean±SD.n=15.**P＜0.01 vs healthy group；##P＜0.01 vs slight group；△△P＜0.01 vs moderate group.图4 CD68-MMP-2 DIF染色结果

5 相关性分析结果

根据Pearson相关分析结果可得，CD68-CypA双阳性细胞的相关系数：r=0.959，P=0.000；CD68-CD147双阳性细胞的相关系数：r=0.948，P=0.000，CD68-MMP-2双阳性细胞的相关系数：r=0.945，P=0.000（图5）；表明CD68-CypA双阳性细胞、CD68-CD147双阳性细胞及CD68-MMP-2双阳性细胞密度和牙周炎炎症程度呈正相关。

根据Pearson相关分析结果可得，各组中CD68-CypA双阳性表达水平与CD68-MMP-2呈正相关（r=0.933，P=0.000）；CD68-CD147双阳性表达与CD68-MMP-2双阳性表达呈正相关（r=0.954，P=0.000），见图6；表明CD68-CypA和CD68-CD147双阳性表达均与CD68-MMP2双阳性表达水平呈正相关。

讨 论

牙周炎的病理特征是牙齿周围支持组织的破坏，虽然目前关于牙周炎的免疫应答机制已经各方面反复进行的研究，但在引起牙周组织感染的细胞因子以及相关的免疫机制仍未明确。在本研究中，以CD68+作为单核/巨噬细胞的标记物，通过免疫荧光染色法观察到CD68+的表达水平在炎症牙龈组织中增多，对比各组间数据可见其表达量随炎症程度升高而显著增多，与国内外的研究结果基本相符［1-3］。该结果提示，单核/巨噬细胞的表达水平可以反映出慢性牙周炎的炎症程度以及牙周组织临床破坏的程度，其量化标准具有一定的参照意义，再次印证单核/巨噬细胞的表达是判断牙周炎症的其中一项指标。

Figure 5.The Pearson analysis of CD68-CypA，CD68-CD147 and CD68-MMP-2 double-positive cell density and the severity of periodontitis.Pearson correlation of CD68-CypA double-positive cell density is r=0.959，P=0.000；CD68-CD147 double-positive cell density is r=0.948，P=0.000；CD68-MMP-2 double-positive cell density is r=0.945，P=0.000.图5 Pearson相关性分析

Figure 6.The Pearson analysis of CD68-CypA，CD68-CD147 and CD68-MMP-2 double-positive cell density and the severity of periodontitis.Pearson correlation of CD68-CypA double-positive cell density and CD68-MMP-2 double-positive cell density is r=0.933，P=0.000；CD68-CD147 double-positive cell density and CD68-MMP-2 double-positive cell density is r=0.954，P=0.000.图6 CD68-CypA、CD68-CD147双阳性表达与CD68-MMP-2双阳性水平呈正相关

CypA作为促炎细胞因子，不仅可以促进炎症反应，还可加重炎症反应［4-5］。在人慢性牙周炎牙龈组织上观察到CypA和CD147的表达高于健康牙龈，且与CD68+细胞定位高度重合［8，13-16］。在本研究中，我们观察到CypA的表达与牙周炎的炎症程度正相关，验证了CypA在牙周炎症组织中的重要作用［15-16］。本研究通过免疫双荧光染色观察到CD68与CypA、CD68与CD147共定位，牙周炎组中双阳性细胞密度高于健康组，且计算得到其双阳性细胞密度与牙周炎症程度呈正比，间接提示CypA和CD147可能通过趋化单核/巨噬细胞参与牙周炎病程，这与目前的研究报道相符［6，15-17］。

机体在正常生理状态下，MMPs低水平表达以维持组织内稳态；当病理情况下，其表达水平与激活状态增高，在牙周炎中表现为降解破坏牙周组织细胞外基质，MMP-2是参与组织动态平衡与重塑的MMPs之一，具有一定的促炎作用［18-19］。在本研究中，观察到MMP-2在健康牙龈组织中可有少量表达，炎症组织中表达增多；CD68-MMP-2双阳性细胞表达量与牙周炎症水平呈正相关。结合本实验中CypA、CD147和MMP-2在炎症组织中的表达情况，提示CypA及CD147可能对MMP-2存在正向调控作用，在CypA/CD147复合体的作用下牙周炎症加重，并且可能对MMP-2表达有促进作用，但具体机制还需进一步研究。

综上所述，我们通过DIF法观察到CD68-CypA双阳性细胞、CD68-CD147双阳性细胞及CD68-MMP-2双阳性细胞在人健康及慢性牙周炎牙龈组织中均有不同程度表达，提示在CD68+细胞上CypA、CD147可能对MMP-2的表达有促进作用，且CD68-CypA、CD68-CD147及CD68-MMP-2双阳性细胞可能参与牙周组织的降解破坏，并在与其他细胞因子协助下加重牙周炎症的进展，因此调控MMP-2的水平有望成为防治牙周炎的潜在研究方向，然而由于CypA/CD147相互作用复杂，对于其相互作用及对MMP-2的调控的具体机制尚需深入探究。