基于酶催化反应测定15N标记尿素同位素丰度*

赵 诚， 解 龙， 徐巾岚

(上海化工研究院有限公司/上海市稳定同位素检测及应用研发专业技术服务平台 上海 200062)

氮元素是植物生长发育所必需的营养元素之一，是构成植物蛋白质的重要成分，在多个方面直接或间接影响植物的代谢活动和生长发育[1-2]。随着近年来农业氮迁移转化过程等研究领域的发展，15N标记示踪技术在生态系统氮循环研究中发挥了重要作用。15N标记示踪技术是将一定数量的15N标记示踪剂(如15N标记尿素)添加到生态系统(植物、土壤或整个生态系统)中，经过一段时间后分析其去向[3-5]。在生态系统氮循环研究方面，15N标记示踪技术不受稳定同位素分馏效应的影响，具有15N自然丰度法和传统示踪法所不具备的优点。15N标记尿素作为15N标记示踪剂在农业科学中的应用研究十分广泛，已应用于陆地生态环境系统尺度上的各个方面，如分析氮的来源、分配[6]、利用率和去向[7-8]、转化以及损失等[9-11]，从而能够加深对生态系统尺度上氮循环的认识和提升氮管理的能力。在这些前沿基础科学研究的过程中，15N肥料利用率、15N损失率、15N残留率和15N氮肥分配率等，均与15N标记示踪剂的同位素丰度直接相关，因此，15N标记尿素同位素丰度的准确测定显得尤为重要。

现有的15N标记尿素同位素丰度检测方法主要有气相色谱-燃烧-同位素比值质谱法[12]、中红外光谱法[13]、气体同位素质谱法[14-15]等。15N同位素丰度范围0.365%～99%的15N标记尿素均可以作为示踪剂，气体同位素质谱法在该范围内能够准确测定15N同位素丰度，因此，气体同位素质谱法是目前主要的检测方法。

气体同位素质谱法现有的前处理方法有消化法-次溴酸盐氧化联用法和微量高温燃烧法。消化法-次溴酸盐氧化联用法是在浓硫酸和接触剂的作用下，先将15N标记尿素消解生成15N标记铵盐，然后在碱性条件下通过凯氏定氮仪蒸馏出15N标记氨水，再用酸吸收得到15N标记铵盐，浓缩后用次溴酸钠转化为15N标记氮气，整个前处理过程耗时约5 h，样品消耗量在100 mg以上。微量高温燃烧法是将15N标记尿素样品中的氮元素高温氧化为氮氧化物，氮氧化物经过铜丝还原生成15N标记氮气，整个前处理过程耗时约6 h，样品消耗量在10 mg左右。上述2种前处理过程耗时均较长，因此开发一种快速的、测试结果准确的15N标记尿素同位素丰度检测方法显得尤为重要。

脲酶催化尿素测定含量的方法已经比较成熟[16-18]，但用于15N标记尿素同位素丰度的测定却未见文献报道。本研究主要对脲酶催化反应时间、铵盐吸收反应时间和温度等参数进行了考察，并就酶催化法与微量高温燃烧法(相比消化法-次溴酸盐氧化联用法样品消耗量少)测定15N同位素丰度的结果、方法精密度、准确度等进行了对比，初步建立了基于酶催化反应测定15N标记尿素同位素丰度的方法。

1 试验部分

1.1 主要仪器与试剂

MAT-271型气体同位素质谱仪，美国Finnigan质谱公司；DF-101Z型智能集热式恒温磁力搅拌器，上海卫凯仪器设备有限公司；SX2-4-10型箱式电阻炉，上海实研电炉有限公司。

15N标记尿素，15N同位素丰度分别为5.10%、10.15%、60.18%、98.14%、99.18%，纯度均≥98.5%，上海化工研究院有限公司；脲酶，约1 U/mg，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；块状氧化钙，分析纯(AR)，上海麦克林生化科技有限公司；溴、氢氧化钠、线状氧化铜、溴甲酚绿指示剂、甲基红、乙醇均为AR，分子筛(5A)、铜丝(纯度99.9%)、尿素(AR，15N同位素天然丰度为0.365%)，国药集团化学试剂有限公司；浓硫酸，AR，江苏强盛化工有限公司。

1.2 质谱条件

电子轰击(EI)离子源；法拉第杯；电子能量100 eV；离子源温度129 ℃；高压9.8 kV；质荷比28～45。

1.3 试验方法

1.3.1 微量高温燃烧法

(1)反应原理

在真空、高温条件下，氧化铜分解释放氧气，氧气将15N标记尿素样品中的氮元素氧化为氮氧化物，氮氧化物经铜丝还原生成15N标记氮气[14]，将15N标记氮气引入气体同位素质谱仪中检测质荷比为28、29和30的离子流强度，并根据不同丰度范围计算15N同位素丰度。

(2)样品前处理

将块状氧化钙、分子筛分别破碎后过0.85 mm(20目)筛。将氧化钙、分子筛、线状氧化铜放在马弗炉中520 ℃干燥2～4 h，于100 ℃ 下干燥玻璃反应管2～4 h。5～10 mg15N标记尿素样品、20～30 mg线状氧化铜、4根1～2 cm长的铜丝、20～30 mg氧化钙、4～8粒分子筛加入玻璃反应管[见图1(a)]中。通过真空橡胶管将玻璃反应管的“1”连接抽真空系统，待真空度低于50 Pa时，使用丁烷喷枪将玻璃反应管的“2”熔封[19]。熔封后的玻璃反应管放入箱式电阻炉中在520 ℃下反应4 h，反应结束后冷却至室温，玻璃反应管放入进样管[见图1(b)]中，进样管的“3”连接气体同位素质谱仪，抽真空，待真空度达到仪器要求后，通过旋转“5”将反应管易碎处折断并释放气体，将气体引入气体同位素质谱仪中检测质荷比为28、29和30的离子流强度。

1.连接抽真空系统；2.丁烷喷枪熔封位置；3.连接气体同位素质谱仪接口；4.熔封后的反应管易碎处；5.通过旋转将反应管易碎处折断并释放气体；6、7.连接密封

1.3.2 脲酶催化法

(1)反应原理

脲酶催化法反应分为三步：第一步，酶具有非常高的专一性，15N标记尿素在脲酶溶液的存在下催化转化生成15N标记碳酸铵，即反应方程式(1)；第二步，15N标记碳酸铵在碱性、65 ℃条件下分解产生15N标记氨气，酸吸收15N标记氨气生成15N标记铵盐，即反应方程式(2)和(3)；第三步，15N标记铵盐与次溴酸钠反应生成15N标记氮气，即反应方程式(4)。通过酶催化反应得到的15N标记氮气引入气体同位素质谱仪中，检测质荷比为28和29的离子流强度，并计算15N同位素丰度。

(3)

(4)

(2)样品前处理

脲酶催化法反应分为三步，故前处理也分为三步：第一步，取10～15 mg15N标记尿素、50 mg脲酶加入铵盐吸收装置(见图2)的50 mL烧杯中，加2 mL 4 mol/L硫酸溶液于10 mL烧杯中，加5 mL蒸馏水于50 mL烧杯中，2只烧杯中分别加入几滴溴甲酚绿-甲基红指示剂，用封口膜将50 mL烧杯封口，在40 ℃条件下酶催化反应10 min；第二步，打开封口膜，加2 mL 10 mol/L氢氧化钠溶液于50 mL烧杯中，用封口膜将50 mL烧杯封口，在 65 ℃条件下50 mL烧杯中产生的15N 标记氨气被10 mL烧杯中的硫酸溶液吸收，10 min后打开封口膜；第三步，从上述10 mL烧杯中取2 mL的样本于双球反应管[见图3(a)]“A”球泡中，向双球反应管“B”球泡中加入1 mL碱性次溴酸钠溶液[20]，将进样旋塞阀[见图3(b)]的“1”连接抽真空系统，进样旋塞阀的“3”连接双球反应管的“4”，打开进样旋塞阀的阀门“2”，待真空度低于50 Pa后，关闭进样旋塞阀的阀门“2”，一同取下进样旋塞阀和双球反应管，将双球反应管“B”球泡中的次溴酸钠溶液加入到“A”球泡中，反应生成15N标记氮气。将进样旋塞阀的“1”连接气体同位素质谱仪，将双球反应管放入液氮中，抽真空，待真空度达到仪器测试要求后，打开进样旋塞阀的阀门“2”，将生成的15N标记氮气引入气体同位素质谱仪中，检测质荷比为28、29和30的离子流强度，根据不同丰度范围计算15N同位素丰度。

图2 铵盐吸收装置示意

1.连接抽真空系统；2.进样旋塞阀的阀门；3、4.连接密封

1.4 15N同位素丰度计算

氮元素在自然界中有14N和15N等2种稳定同位素，同位素分布有14N14N、14N15N、15N15N等3种组合形式，14N14N质荷比为28，14N15N质荷比为29，15N15N质荷比为30。将反应生成的15N标记氮气引入气体同位素质谱仪中检测质荷比为28、29和30的离子流强度，根据不同丰度范围选择不同的计算公式[21-22]。理论上式(1)和式(2)的计算结果是一致的，但当15N同位素丰度≤10%时，由于质荷比为30的离子流强度非常低，选择式(1)计算15N同位素丰度；当15N同位素丰度>10%时，为避免进样过程中微量空气的漏入对质荷比为28的离子流强度的干扰，选择式(2)计算15N同位素丰度。

(1)

(2)

式中：E——待测物质15N同位素丰度，%

I28、I29、I30——质荷比分别为28、29、30的离子流强度，%。

2 结果与讨论

2.1 脲酶催化反应时间

酶催化反应具有温和性、高效性和专一性三大特点，酶的温和性是指酶催化反应需要在相对适宜的pH和温度条件下进行，pH过高或过低都会导致酶失活，高温也会导致酶失活，低温则会导致酶的活性不足。脲酶活性最佳pH为7.4，15N标记尿素与脲酶溶液的pH接近7.0，pH在适宜的范围内。脲酶在40～45 ℃反应活性较高，因此选择40 ℃作为酶催化反应温度。尽管酶的催化效率比无机催化剂更高，但反应速率不如酸碱滴定反应快，因此选择合适的反应时间是准确测定15N同位素丰度的关键。40 ℃条件下过量的脲酶在1 h内可将15N标记尿素完全分解[17]。

在样品前处理时将氢氧化钠溶液加入50 mL烧杯后，烧杯中的溶液呈碱性，脲酶失活，脲酶催化反应终止。因此，反应时间是从向50 mL烧杯中加入蒸馏水开始，到加入氢氧化钠溶液结束。

取10 mg15N同位素丰度为10.15%的15N标记尿素为试验样品，再取50 mg脲酶，铵盐吸收反应时间为10 min，检测质荷比为28的离子流强度，设置脲酶催化反应时间为60 min的离子流强度为100%，其余脲酶催化反应时间的相对强度见表1。脲酶催化反应时间为2 min时生成的15N标记氮气较少，15N同位素丰度受本底影响偏低；反应40 min后，质荷比为28的离子流强度变化不明显；反应60 min时，15N标记尿素已经完全分解。试验结果进一步表明脲酶催化反应8 min后测定的15N同位素丰度与完全反应(60 min)时的测试结果一致，为了缩短前处理时间，脲酶催化反应时间选择为10 min。

表1 不同脲酶催化反应时间下的15N同位素丰度

2.2 铵盐吸收反应时间

第一步的脲酶催化反应对15N标记尿素转化为15N标记碳酸铵至关重要，第二步铵盐吸收反应是将15N标记碳酸铵分解的15N标记氨气或氨水吸收到硫酸中，用作第三步制备15N标记氮气的原料，第二步铵盐吸收反应起到了承上启下的作用，铵盐吸收反应时间对15N同位素丰度的检测至关重要。

试验时保持其他条件不变，仅改变第二步铵盐吸收反应时间，考察其对15N同位素丰度的影响。铵盐吸收反应时间是从铵盐吸收装置放入65 ℃水浴中开始，检测质荷比为28的离子流强度，设置铵盐吸收反应时间为80 min的离子流强度为100%，其余铵盐吸收反应时间的相对强度见表2。在65 ℃水浴条件下，15N标记氨气或氨水蒸气释放缓慢，铵盐吸收反应进行60 min后，质荷比为28的离子流强度变化不明显；铵盐吸收反应进行80 min时，15N标记氨气或氨水释放完全。铵盐吸收反应发生2 min时生成的15N标记氮气较少，仅为仪器进样需求的三分之一，与铵盐吸收反应80 min时的15N同位素丰度差异不明显。试验结果进一步表明铵盐吸收反应进行8 min后生成的15N标记氮气可以满足仪器进样要求，为了缩短前处理时间，铵盐吸收反应时间选择为10 min。

表2 不同铵盐吸收反应时间下的15N同位素丰度

2.3 铵盐吸收反应温度

除了反应时间对铵盐吸收过程有影响外，反应温度同样起到了至关重要的作用，因此考察了铵盐吸收反应温度对15N同位素丰度的影响。试验时保持其他条件不变，检测质荷比为28的离子流强度，设置铵盐吸收反应温度为75 ℃的离子流强度为100%，其余铵盐吸收反应温度的相对强度见表3。在25 ℃时，几乎无氨气溢出，次溴酸钠反应后无气体生成；在35 ℃时，次溴酸钠反应后有少量气体生成，15N同位素丰度受本底影响偏低；在铵盐吸收反应温度达到45 ℃以上时，15N同位素丰度趋于稳定，相对强度随着铵盐吸收反应温度的升高而增大，相对强度越大，15N同位素丰度的精密度越好；但在75 ℃时，铵盐吸收装置内会产生雾气，同时水浴锅蒸发较快，因此铵盐吸收反应温度选择为65 ℃。

表3 不同铵盐吸收反应温度下的15N同位素丰度

2.4 方法精密度

按脲酶催化法的前处理方式，对低丰度(10.15%)、中丰度(60.18%)和高丰度(98.14%)3组15N标记尿素进行15N同位素丰度测定，分别平行测定6次，结果见表4。3组不同丰度的15N标记尿素的相对标准偏差(RSD)均小于0.3%，且随着15N同位素丰度的增大，RSD逐渐减小，表明本方法在整个同位素丰度范围内精密度良好。

表4 精密度试验结果

2.5 不同检测方法测定结果对比

采用微量高温燃烧法和脲酶催化法两种样品前处理方式，对6组不同丰度的15N标记尿素进行同位素丰度测定(各平行测定3次)，结果见表5。两种检测方法在15N同位素丰度为0.365%～99.18%内的偏差均小于0.2%，表明建立的检测方法准确度较高。

表5 微量高温燃烧法与酶催化法测定结果对比

微量高温燃烧法不具有专一性，对含氮有机试剂同样适用；酶催化法利用脲酶的专一性，只分解15N标记尿素，整个反应无杂质气体生成。此外，酶催化法耗时0.5 h，微量高温燃烧法至少耗时6 h。因此，酶催化法相对微量高温燃烧法具有很大的优势。

3 结语

通过对脲酶催化反应时间、铵盐吸收反应时间和温度等参数进行考察，确定最优条件下脲酶催化反应时间为10 min，铵盐吸收反应时间和温度分别为10 min和65 ℃，开发了基于酶催化反应测定15N标记尿素同位素丰度的方法。采用微量高温燃烧法和脲酶催化法测定不同15N同位素丰度的尿素样品，两种方法在15N同位素丰度为0.365%～99.18%内的偏差均小于0.2%，表明建立的检测方法准确度较高。低、中、高3组不同15N标记尿素的RSD均小于0.3%，表明方法在整个同位素丰度范围内精密度良好。建立的检测方法适用于15N标记尿素试剂同位素丰度的测定。