基于液相色谱-质谱联用技术的社区获得性肺炎合并脓毒症患者血清脂质组学分析

田红军 徐喜媛 吕娜 杨敬平

脓毒症(Sepsis)是重症监护室(ICU)病人最常见的死亡原因之一[1-2]，因其是感染、烧伤、休克等多种危重症的并发症而难以诊断。目前临床上采用SOFA[Sequential (Sepsis-Related) Organ Failure Assessment]评分法，相比SOFA带有的主观性，生物标志物是在实验室测得，结果更具客观性。社区获得性肺炎(Community-Acquired Pneumonia, CAP)指在医疗机构外罹患的肺炎,属呼吸系统常见疾病,发病率及病死率均较高。脓毒症(Sepsis)是由宿主对感染的免疫反应失调而引起一种危及生命的器官功能障碍,是CAP严重并发症之一,与其不良预后密切相关。成人CAP 医院外因感染引起的肺实质炎性疾病在全球各年龄组都有较高的发病率和死亡率。因此，寻找特异性的生物标志物对于脓毒症的早诊断、早治疗以及降低患者死亡率，提高生存率具有重要意义。本研究将我院收集到的社区获得性肺炎合并脓毒症患者与正常人血液样本，非靶向地鉴定出与社区获得性肺炎合并脓毒症相关的脂质分子；对其进行多维统计分析，筛选出具有代表性的脂质分子和相关代谢物，探索将血液中的脂质分子与其代谢相关基因作为诊断社区获得性肺炎合并脓毒症的生物学标志物的价值。

资料与方法

一、 研究对象

选取2018 年 09 月至2020 年09月期间，于内蒙古包钢医院呼吸与危重症医学科确诊的30例社区获得性肺炎合并脓毒症患者(CAP+sepsis组)和16例健康体检志愿者(NC组)的外周血液标本3mL。纳入标准如下[3]：(1)临床资料齐全；(2)患者符合美国重症医学会制定的脓毒症和社区获得性肺炎诊断标准；(3)无其他系统性疾病；(4)患者及其家属签订知情同意书。排除肝肾功能不全、血液系统疾病以及免疫系统受损者。根据社区获得性肺炎合并脓毒症患者感染指征和重症患者SOFA评分(SOFA评分≥2分者认定为脓毒症患者)为CAP+sepsis组。本研究经院伦理委员会批准通过(编号2019MER-053)。

二、主要仪器与试剂

采用UHPLC Nexera LC-30A液相色谱仪(日本岛津)与UPLC-Q-TOF/MS质谱仪(美国Waters)联用进行脂质组学分析。分别使用正负离子扫描模式对样本进行检测，色谱柱为ACQUITY UPLCC柱(10 mm x 2.1 mm，1.7m，美国Waters公司)。甲醇、乙腈(HPLC级，Merck公司)；乙酸铵(HPLC级)、内标脂肪酸FFA16.d3和FFA18.d3(Sigma公司)；磷脂酰胆碱PC38:0、磷脂酰乙醇胺PE34:0、溶血性磷脂酰胆碱LPC19:0、鞘脂SM12:0、甘油三酯TAG45:0和神经酰胺Cer17:0(美国Avanti Polar Lipids公司)。血液总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒购自美国Promega公司，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列(见表1)。

表1 实时荧光定量PCR引物列表

三、方法

1. 样品制备 将EDTA抗凝血3mL室温下放置25分钟，在低温(4℃)下1000g离心15min，上层的血浆移至离心管中，-80℃冻存备用；NC组留取的标本同样方法处理。两组所得血清在液相色谱仪下行分析，检测其脂质分子及其相关代谢产物含量。

2. 质谱分析条件 电喷雾电离样本，利用正离子和负离子模式进行检测，电喷雾电子源质谱正离子模式检测：lysophosphatidylcholine(LPC)、lysophosphatidylethanolamine (LPE)及Ceramide(Cer)；负离子模式检测：lysophosphatidic acid(LPA)、lysophosphotidylserine(LPS)及sphingsine-1-phosphate(S1P)。质谱ESI源参数设置：离子源气1(Gas1)为45，气帘气(Cur)为25，离子源气2(Gas2)为50，电喷雾电压5500V(正离子模式)/-4500V(负离子模式)，离子源温度500℃。对其优化的每个脂质相对应的母离子、特征子离子、去簇电压(DP)和碰撞能量(CE)，建立质谱mutipul reactions monitor(MRM)模式，并进行定量检测。

3． PCR 通过PCR检验样本RNA表达量。

四、统计学分析

采用SPSS 23.0 软件进行统计分析，t检验进行组间分析，检验水平P<0.05为差异具有统计学意义。通过Spearman相关性分析、主成分分析及其神经网分析，得到影响明显的脂质代谢物组成成分。社区获得性肺炎合并脓毒症诊断中脂质分子相关变化，通过曲线分析评估其准确性。

结 果

一、社区获得性肺炎合并脓毒症患者与健康者年龄及性别的比较

两组患者性别、年龄上的比较，无统计学差异(见表2)。

表2 CAP+sepsis组与NC组年龄及性别的比较

二、社区获得性肺炎合并脓毒症患者与健康者血清中脂质含量差异

通过对CAP+sepsis组与NC组血清中脂质各组分进行液相-气相分析发现，脂质成分含量有明显差异的有14种，除棕榈酰神经酰胺(Cer16:0)、硬脂酰神经酰胺(Cer18:0)和花生酸神经酰胺(Cer20:0)在CAP+sepsis组中含量明显升高(P<0.003)，其余组分NC组均明显低于病例组(P<0.001)，差异具有统计学意义，其中，LPE18:1、LPE16:0及LPA18:2差异最明显(见表3)。

表3 CAP+sepsis组与NC组脂质含量差异比较

三、CAP+sepsis组各脂质组分的等级相关性分析

CAP+sepsis组各脂质组分含量与社区获得性肺炎合并脓毒症分别进行等级相关分析(Spearman)，Cer16:0、Cer18:0、Cer20:0与社区获得性肺炎合并脓毒症为正相关，且具有明显的统计学差异(P<0.01)。其余脂质组分均呈现负相关，其中LPA18:2、LPA20:4、LPC16:0、LPC18:2、LPE16:0、LPE18:2、LPE18:1负相关系数均大于0.6，所有14组数据Spearman相关均有统计学差异(均P<0.01,见表4)。

表4 CAP+sepsis组各脂质组分的等级相关性分析(n=30)

四、CAP+sepsis组各脂质组分主成分分析

对CAP+sepsis组各脂质14个组分进行主成分分析(PCA),KMO检验系数0.61，Bartlett检验P<0.001,提示可以进行主成分分析。结合碎石图(见图1)，取特征值>1的前4位主成分，分别解释24.1%、15.9%、11.4%及9.8%的总数据变异，解释了61.1%的数据变异(累积贡献率为61.1%，见表5)。应用旋转成份矩阵分析显示：LPA 18:2、LPE 18:0及S1P反应第1主成分变化，LPA20:4、LPE18:1及LPC18:1反应第二主成分变化，LPC18:2反应第3主成分、CER16:0反应第4主成分变化。

表5 CAP+sepsis组变量相关矩阵的特征根值

图1 CAP+sepsis组14个脂质组分主成分分析碎石图

五、神经网络多层感知器网络分析

各个因子变量网络分析结果在网络中变量重要性排名(见图2)。重要性标准化百分比分别为：LPE18:2(100.0%)、LPE16:0(91.2%)、LPA20:4(84.3%)、LPE18:1(73.3%)对脓毒血症非常重要。

图2 CAP+sepsis组神经网络分析各因子重要性排名

六、脂质代谢相关基因定量分析

脂质代谢由复杂的调控通路构成，不同的组织、细胞参与脂质代谢的基因也不同。通过上述脂质代谢分析表明，LPA、LPE在脓毒症患者中有较大意义。所以，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测血液中参与LPA、LPE代谢相关的基因的mRNA表达量，其中，合成LPA的ATX、LIPH基因，分解LPA的LPP基因，合成LPE的PLA2G2A、PLA2G15基因，分解LPE的LPEAT2基因，明确LPA、LPE相关代谢通路关键酶学的基因变化。结果显示：合成LPA的ATX和LIPH基因在NC组及CAP+sepsis组分别为1.011 ± 0.057和1.010 ± 0.053及0.352 ± 0.033和0.357 ± 0.018，NC组明显高于CAP+sepsis组(t=9.99和11.75，均P<0.0001)。分解LPA的LPP基因在NC组及CAP+sepsis组分别为0.366 ± 0.050及1.013 ± 0.060，NC组明显低于CAP+sepsis组(t=8.299，P<0.0001)。合成LPE的PLA2G2A和PLA2G15基因在NC组及CAP+sepsis组分别为1.031 ± 0.094和1.018 ± 0.070及0.032±0.003和0.390±0.021，NC组明显高于CAP+sepsis组(t=10.56和8.645，均P<0.0001)。分解LPE的LPEAT2(t=9.077，P<0.0001)基因在NC组及CAP+sepsis组分别为0.870±0.080及0.128±0.015，NC组也明显高于CAP+sepsis组。

七、脓毒症相关的脂质组分对脓毒症的诊断价值分析

过主成分分析筛选出与脓毒症相关性较强的4种脂质代谢组分LPA 18:2、LPA 18:0(与第1主成分)、LPE 18:1、LPE16:0 (神经网络前2名)及其代谢通路关键酶：合成LPA的ATX、LIPH基因，分解LPA的LPP基因，合成LPE的PLA2G2A、PLA2G15基因，分解LPE的LPEAT2基因，采用ROC曲线对这些指标进行了脓毒症诊断的灵敏度和特异分析，结果LPA 18:2、LPA 18:0、LPE 18:1及LPE16:0曲线下面积分别为：0.95、0.89、0.87及0.86，LPA18:2的诊断准确性较高(见图3)。

图3 CAP+sepsis组LPA 18:2、LPA 18:0、LPE 18:1及LPE16:0 ROC曲线

讨 论

脓毒症具有极高的发病率和死亡率[3]，很难早期发现和快速确诊，当出现了明显的症状，往往很快恶化为多脏器功能衰竭，增加死亡风险。因此，找到具有高敏感性、高特异性的生物标志物，是实现对社区获得性肺炎合并脓毒症的早诊断、早治疗、提高其生存率及改善其预后的关键措施。目前报道的脓毒症相关生物标志物已经超过了170种，包括细胞因子类、细胞表面分子、补体、凝血因子、急性时相反应蛋白等，但没有可以被认定为社区获得性肺炎合并脓毒症特异性的诊断标记物[1-4]。虽然C反应蛋白和血清降钙素原二者均为感染、炎症相关因子，且较为常用，但也不具备特异性的诊断价值。

有研究表明，脂质的代谢变化与脓毒症存在相关性[5-6]，提示其可能成为潜在诊断社区获得性肺炎合并脓毒症的生物标志物。血液样本是一个复杂的基质，包含一大群甘油脂 (GPs)、糖脂 (SLs)、胆固醇酯 (CEs) 和三酰基甘油 (TGs)。由于血流与生物体中的大多数器官及其单个细胞有关。在比较血浆和血清时，据报道，在血清中可以表征比血浆中更稳定的脂质谱[5-6]。因此，更可靠分析的潜在替代方法是在血清中进行脂质研究和方法开发。结合上述研究背景，本研究通过脂质代谢组学分析，发现了11种在社区获得性肺炎合并脓毒症患者血浆中含量明显降低的脂质(见表3)，其中LPA 18:2、LPE 18:1及LPE16:0 是与社区获得性肺炎合并脓毒症关联最紧密的脂质分子，对社区获得性肺炎合并脓毒症的预测准确率也高于LPC。同时还存在3种在社区获得性肺炎合并脓毒症患者血浆中含量明显升高的脂质，即Cer16:0、Cer18:0、Cer20:0，与Drobnik等的结果一致[7]，其可能与炎症因子诱发的鞘磷脂代谢增强相关[8]；

最近的研究表明，LPA 能够减轻脓毒症状态下的器官损伤，在脓毒血症中具有抗炎作用[9]。血液中的LPA主要通过两种途径合成，ATX与LIPH分别以LPC与PA为底物合成LPA[12]。与此同时，LPP可参与降解LPA，来维持LPA动态平衡。本研究通过RT-qPCR检测发现脓毒症患者血液中ATX与LIPH表达量明显降低，而LPP表达量升高，LPA合成减少并被大量降解，与血液中LPA测定含量降低呈一致性，提示脓毒症状态下LPA动态平衡被打破，不能有效维持其代谢水平，促进疾病的发生发展。

溶血磷脂酰乙醇胺 (LPE, Lys phosphatidylethanolamine) 是一种脂质代谢物，由多种细胞产生，参与各种免疫调节反应。研究结果表明LPE对LPS诱导的细胞炎症和氧化应激具有显著的保护作用。细胞内的LPE可通过磷脂酶A2(PLA2)合成[10-11]，并经乙酰化酶降解[12-13]。PLA2家族有多个成员，其中的PLA2G2A与PLA2G15参与了细胞LPE合成，而参与LPE分解酶却只有LPEAT2[14-15]。本研究通过RT-qPCR检测发现脓毒症患者血液中PLA2G2A与PLA2G15表达量均降低，而LPEAT2表达量也显著降低，提示脓毒症患者血液中的LPE可能存在其他代谢途径参与疾病发生发展。

本研究经液相色谱-质谱联用分析[8]，发现了社区获得性肺炎合并脓毒症患者的外周血中，脂质分子的含量与脂质代谢相关基因表达发生了显著的变化，脓毒症患者中LPA 18:2、LPA 20:4、S1P、LPC 16:0、LPC 18:2、LPC 18:1、LPC 18:0、LPE 16:0、LPE 18:2、LPE 18:1、LPE 18:0低表达，而Cer16:0、Cer18:0、Cer20:0呈高表达；这种多种脂质小分子的含量变化提示脓毒症过程中脂质代谢差异可能与炎症反应中不同的脂质代谢过程相关。而其中LPA 18:2、LPA 18:0、LPE 18:1及LPE16:0 四种脂质代谢组分参与了脓毒症的瀑布式炎症反应，经统计分析LPA 18:2、LPA 18:0、LPE 18:1及LPE16:0曲线下面积分别为：0.95、0.89、0.87及0.86，LPA18:2具有极高的脓毒症诊断敏感性，提示其可以作为社区获得性肺炎合并脓毒症诊断的候选生物标志物。但其特异性与敏感性还需要进一步进行大规模验证，才能为临床诊断社区获得性肺炎合并脓毒症提供准确、新型的生物标志物。

本研究局限性：纳入病例的数量较少，因此研究可能存在局限性，后续实验可以增加病例数量。