青光安颗粒剂对DBA/2J小鼠视网膜中自噬途径相关蛋白表达的影响

吴凯，陈立浩，时健，刘倩宏，姚小磊

青光眼为第2 大常见视力丧失原因，全球超过6,000 万人受到青光眼导致的视力丧失的影响[1]。视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）的凋亡是青光眼致盲的主要原因[2-3]，而线粒体自噬又与RGCs 的凋亡密切相关[4]。临床上，保护RGCs 的方法十分局限，寻找保护RGCs 的中药显得十分重要。有研究[5]指出，眼血流量减少和波动是青光眼发展的重要原因，验证了青光眼的病机为血瘀水停[6]。据此青光安颗粒剂（QingguanganGranules，QGA）应运而生，由黄芪、茯苓、白术、赤芍、生地黄、地龙、红花、车前子组成，具有益气活血，利水明目之功。前期研究[7]证明QGA 能够保护RGCs 形态并减少其凋亡，其疗效在临床上也得到有效验证[8]，但作用机制尚未探明。根据线粒体自噬与RGCs 损伤的关系，猜测QGA 可能是通过调控线粒体自噬来保护RGCs 的，为了验证这一猜想，本研究拟采用高眼压动物模型进行实验。DBA/2J 小鼠为近年来基于转基因技术应用最为广泛的自发性高眼压实验动物模型，8～9 月龄出现RGCs 凋亡和视神经变性，18月龄可出现90%以上的视神经变性。因此，以DBA/2J 小鼠为实验对象，就QGA 对自噬途径相关蛋白表达的影响进行探索，以阐明QGA 保护RGCs的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

C57BL/6J 小鼠10 只，雌性，质量18～22 g，2 月龄，SPF级，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物质量合格证号：SCXK（湘）2020-0002；动物DBA/2J 小鼠30 只，雌性，质量18～22 g，56～76 日龄，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物质量合格证号：SCXK（京）2020-0006。本研究实验动物及实验所用条件符合国家科学技术委员会的《实验动物管理条例》相关规定，由湖南中医药大学动物实验福利伦理审查委员会获批，伦理审批号：LL2019100802。

1.2 试剂、仪器与药品

放射免疫沉淀法（radio immune precipitation assay，RIPA）细胞裂解液（北京普利莱基因技术有限公司，C1053）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒（康为世纪生物科技股份有限公司，CW0014S)；兔抗微管相关蛋白轻链3B（microtubule-associated protein light chain 3B，LC3B）抗体（上海艾博抗贸易有限公司，ab51520）；兔抗细胞色素C（cytochrome C，CytC）抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，10993-1-ap）；兔抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗体（美国Immunoway公司，YT0656）；兔抗溶酶体相关膜蛋白1（lysosome-associated membrane protein 1，LAMP1）抗体（江苏亲科生物研究中心有限公司，df7033）；二抗辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（北京中杉金桥生物技术有限公司，ZB-2301)；超纯RNA 提取试剂盒（康为世纪生物科技股份有限公司，CW0581M）。

低温高速离心机（德国Eppendorf 公司，5424R）；全自动酶标仪（北京市六一仪器厂，WD-2102B）；蛋白垂直电泳仪（北京市六一仪器厂，DYY-6C）；荧光PCR 仪（上海伯乐生命医学产品有限公司，CFX ConnectTM）；笔式眼压计（美国Reichert公司，Tono-pen AVIA）。

QGA 药物组成：QGA 由颗粒剂黄芪30 g、茯苓20 g、白术10 g、赤芍10 g、生地黄10 g、地龙10 g、红花5 g、车前子20 g 组成，购自湖南中医药大学第一附属医院，根据小鼠每天的用药剂量分袋密封包装，室温条件下储存在阴凉干燥处，灌胃前加入适量水溶解并加热。

1.3 青光眼动物模型的建立

本实验青光眼动物模型的建立采用DBA/2J 转基因小鼠[9]，本实验喂养DBA/2J 小鼠至38 周龄自动成模，并用Tono-pen 笔式眼压计动态观察小鼠眼压变化。

1.4 青光眼小鼠分组及给药方法

10 只C57BL/6J 小鼠设为对照组（control group，CG），30只DBA/2J小鼠采用随机数字法分为模型组（model group，MG）、QGA 低剂量组（low-doseQingguangangroup，LQGA）青光安高剂量组（highdoseQingguangangroup，HQGA）。CG 组和MG 组以生理盐水0.9 mL灌胃，每日1次；低剂量组、高剂量组分别以20.75 g/kg、103.75 g/kg的剂量每日灌胃1次，每次0.9 mL，共给药15 d。

1.5 检测眼压

将小鼠眼球表面麻醉后，使用Tono-pen 笔式眼压计轻触小鼠眼球，连续轻触10次读取显示屏上的眼压值，从第10 周开始，每4 周测1 次，待DBA/2J 小鼠眼压升高以及趋于稳定后停测。

1.6 取材

取各组小鼠，麻醉后取出左眼球。左眼球钝性分离，剥离视网膜，按照视网膜4 个象限，将视网膜对称剪成上下2 份，置入EP 管内，放入液氮罐中低温保存。

1.7 Western Blot 检 测LC3、LAMP1、Caspase-3、CytC蛋白表达

各组采用Western Blot 研 究LC3、LAMP1、Caspase-3、CytC 蛋白表达。提取视网膜组织蛋白，测定蛋白浓度并进行蛋白定量，经凝胶、电泳和转膜后用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗室温孵育2 h，后将膜冲洗之后加入二抗37°C 孵育1 h，最后采用化学发光显影，以GAPDH 为内参计算目的蛋白的相对表达量。

1.8 qRT-PCR 检测Parkin mRNA、LAMP1 mRNA、Caspase-3 mRNA表达

各组采用实时荧光定量PCR（quantitative realtime PCR，qRT-PCR）方法检测Parkin mRNA、LAMP1 mRNA、Caspase-3 mRNA的表达。剪取组织样品置于离心管内，研磨充分后进行震荡和离心，把离心后的水相层转移到新的离心管中。加入乙醇后混匀，反复离心，提取RNA。测定RNA浓度、纯度。然后配制逆转录反应体系，将RNA 逆转录成cDNA，最后荧光定量PCR，引物信息如表所示（表1）。

表1 引物信息

1.9 统计学方法

采用SPSS 25.0统计软件对数据进行分析，计量资料数据采用均数±标准差（）表示，符合正态分布且方差齐的计量资料，使用方差分析（ANOVA）进行多组变量间的相互比较，两两比较采用LSD-t检验。不符合正态分布或方差不齐的计量资料采用以下检验方式：同组小鼠不同时间点的眼压比较采用多个相关样本的非参数Friedman 检验，同一时间点不同组小鼠眼压比较采用两独立样本非参数Mann-Whitney U 检验，不同组小鼠蛋白量或mRNA表达量比较采用Wilcoxon 秩和检验，当P＜0.05 时被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 眼压检测结果

10只C57BL/6J小鼠（20眼）在第10周至第38周眼压波动于10～16 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）之间，30 只DBA/2J 小鼠（60 只眼）眼压在第10 周至第38 周，随时间逐渐上升（表2）。同组小鼠不同时间点的眼压比较，不符合正态分布，采用多个相关样本的非参数Friedman 检验，结果显示C57BL/6J小鼠在第10 周至第38 周眼压均无明显差异（P>0.05），DBA/2J 小鼠在第10 周至第38 周眼压逐渐上升，差异具有统计学意义（Z=136.034，P=0.000）。同一时间点不同组小鼠比较，眼压不符合正态分布，采用两独立样本非参数Mann-Whitney U 检验。结果显示，DBA/2J 组小鼠眼压逐渐升高，在第10 周显著高于C57BL/6J组，差异具有统计学意义（Z=-2.645，P=0.008）。

表2 C57BL/6J小鼠与DBA/2J小鼠第10周到第38周不同时相点眼压比较（，n=20）

表2 C57BL/6J小鼠与DBA/2J小鼠第10周到第38周不同时相点眼压比较（，n=20）

注：*与C57BL/6J组同时间点比较，P<0.05.

2.2 QGA 对DBA/2J 小鼠视网膜LC3-Ⅱ/LC3-I、LAMP1蛋白表达的影响

4 组间小鼠视网膜中LAMP1 蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05），而LC3-Ⅱ/LC3-I 蛋白表达的差异具有统计学意义（F=12.207，P=0.000）。两两比较：与CG 相比，MG 小鼠视网膜LC3-Ⅱ/LC3-I 蛋白表达升高（t=4.697，P=0.000）；与MG 比较，LQGA 与HQGA 小鼠视网膜LC3-Ⅱ/LC3-I 蛋白表达降低（tLQGA=5.140，tHQGA=4.946，均P=0.000），差异均有统计学意义（表3，图1）。

表3 Western Blot检测各组LC3-Ⅱ/LC3-I、LAMP1、Caspase-3、CytC蛋白表达结果（，n=10）

表3 Western Blot检测各组LC3-Ⅱ/LC3-I、LAMP1、Caspase-3、CytC蛋白表达结果（，n=10）

注：*与CG 相比P<0.05；#与MG 相比，P<0.05；CG 对照组；MG模型组；LQGA 青光安低剂量组；HQGA 青光安高剂量组；LC3 微管相关蛋白轻链3；LAMP1 溶酶体相关膜蛋白1；Caspase-3 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；CytC 细胞色素C

图1 线粒体自噬经典泛素化途径相关蛋白Western Blot条带结果

2.3 QGA 对DBA/2J 小鼠视网膜Parkin、LAMP1 mRNA相对表达量的影响

4 组间小鼠视网膜中Parkin mRNA、LAMP1 mRNA 表达差异均有统计学意义（FParkin=153.634，P=0.000，FLAMP1=6.157，P=0.018）。两两比较，（1）Parkin：与CG 相比，MG 小鼠Parkin mRNA 表达降低（t=18.447，P=0.000）；与MG 相比，HQGA 小鼠Parkin mRNA表达升高（t=11.143，P=0.000），差异均有统计学意义。（2）LAMP1：与CG 相比，HQGA 小鼠LAMP1 mRNA 表达降低（t=3.837，P=0.001）；与MG 相比，LQGA 与HQGA 差异均无统计学意义（均P>0.05）；与LQGA 相比，HQGA 小鼠LAMP1 mRNA 表达降低，差异有统计学意义（t=3.454，P=0.003）（表4，图2）。

2.4 QGA 对各组Caspase-3、CytC 蛋白表达以及Caspase-3 mRNA相对表达量的影响

4 组间小鼠视网膜中Caspase-3、CytC 表达量的差异具有统计学意义（FCaspase-3=11.379，P=0.003，FCytC=8.015，P=0.009）。两两比较，（1）Caspase-3 蛋白：与CG 相比，MG 小鼠Caspase-3 表达增高（t=5.408，P=0.000）；与MG 相比，LQGA 与HQGA 小鼠Caspase-3表达降 低（tLQGA=4.529，P=0.000；tHQGA=2.764，P=0.013），差异均有统计学意义。（2）CytC 蛋白：与CG相比，MG 小鼠CytC 表达升高（t=4.705，P=0.000）；与MG 相比，LQGA 小鼠CytC 表达降低（t=2.915，P=0.009），差异均有统计学意义（表3，图1）。（3）Caspase-3 mRNA：4 组间Caspase-3 mRNA 表达差异无统计学意义（P>0.05）（表4、图2）。

图2 qRT-PCR扩增曲线图

表4 qRT-PCR检测各组Parkin、LAMP1、Caspase-3 mRNA结果（，n=10）

表4 qRT-PCR检测各组Parkin、LAMP1、Caspase-3 mRNA结果（，n=10）

注：* 与CG 相比，P<0.05；# 与MG 相比，P<0.05；&与LQGA 相比，P<0.05；CG 对照组；MG 模型组；LQGA 青光安低剂量组；HQGA青光安高剂量组；Parkin E3泛素连接酶；LAMP1 溶酶体相关膜蛋白1、Caspase-3 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3

3 讨论

青光眼可因脾气阳虚、肝肾亏虚导致目窍失养，神水阻滞[10]，病机归纳为“血瘀水停”，因此活血化瘀中药被多数学者所运用[11]。QGA 重用黄芪益气利水，配合茯苓健脾利水，辅以生地黄养血补血，赤芍、红花共奏活血祛瘀之功，地龙力专善走，引诸药到达病所，白术健脾化湿，助茯苓健脾制水，车前利水明目，全方共奏益气活血，利水明目之功。青光眼病理因素包含“痰浊”“瘀血”[12]，异常积累的蛋白与自噬水平的下降导致蛋白无法降解，印证了自噬的不足与“血瘀水停”密切相关[13]。

自噬途径相关蛋白的表达可以反映自噬的完整程度。自噬体形成时，LC3-I 转变为脂质形式的LC3-II，因此LC3-II/LC3-I 的比值与自噬体的数量与完整性相关[14-15]。Parkin 的表达反映了线粒体自噬的信号强度[16]，Caspase-3 反映了细胞凋亡程度[17]，LAMP1 常用于检测自噬溶酶体的形成[18]。线粒体功能障碍时，磷酸酶及张力蛋白同源物诱导的蛋白激酶1（Pink1）磷酸化并附着在线粒体外膜蛋白质上的泛素Ser65位点，靶向募集Parkin至线粒体外膜使线粒体外膜蛋白泛素化[16]。泛素化蛋白被RGCs 的受体蛋白optineurin 识别，同时LC3 与受体蛋白optineurin 结合，LC3-I 转变为LC3-II，LC3-II与自噬体外膜内膜相关联[19]，使线粒体被自噬小泡包裹成自噬体，自噬体与溶酶体结合并在溶酶体中降解，完成完整的Pink1/Parkin 介导的线粒体自噬过程。若自噬体降解受阻，将对细胞产生毒性作用[20]。此外，线粒体自噬本身会使累积的自噬体去极化，膜通透性增加，致使CytC 释放[4]，进而激活Caspase-3，导致RGCs凋亡[21]。

在本实验中，与CG 相比，MG 小鼠中LC3-II/LC3-I、Caspase-3、CytC 蛋白表达均增加，可知MG中线粒体自噬的数量以及RGCs 的凋亡均升高，根据已有的研究[22]，青光眼能诱导线粒体自噬的增加和RGCs 的凋亡，代表模型建立成功。MG 中线粒体自噬增加，自噬体快速堆积，溶酶体降解能力并不能代偿自噬体的堆积速度，过剩的自噬体没有得到有效的清除而积累，使得线粒体自噬不能完成全部过程，大量CytC 释放，激活Caspase-3，导致RGCs 的凋亡。MG 小鼠Parkin mRNA 的含量低于CG，笔者认为造成这种现象可能有3 种原因，一是由于qRTPCR 检测方法的误差，二是在MG 小鼠中，随着视神经中线粒体自噬增加，视网膜RGCs 中的Parkin 已随轴突运行到视神经中，故在视网膜组织中的含量少，三是由于部分CG 小鼠在检测之前就有多余的Parkin蛋白储备，但未行使其功能。

与 MG 相比，LQGA 小鼠 LC3-II/LC3-I、Caspase-3、CytC 蛋白表达均降低，Parkin mRNA、LAMP1 mRNA、Caspase-3 mRNA 表达无明显变化，HQGA 小 鼠LC3-II/LC3-I、Caspase-3 蛋白表达降低，Parkin mRNA 表达增加，LAMP1 mRNA、Caspase-3 mRNA 表达无明显变化。提示青光眼小鼠喂养QGA 后，线粒体自噬信号强度未降低，自噬体的形成减少，减少了自噬体的堆积，使得溶酶体降解能力足够代偿自噬体的堆积，QGA 有利于保护RGCs。虽然以上指标的qRT-PCR 检测和Western Blot检测结果并不完全一致，但没有相反的结果，推测可能是由检测误差引起，或者部分小鼠在检测之前就有多余的蛋白储备，但未行使其功能。

综上所述，QGA 可在一定程度上降低青光眼小鼠视网膜中LC3-II/LC3-I、Caspase-3 的蛋白表达，升高Parkin mRNA 的表达，加强线粒体自噬的信号，降低青光眼小鼠视网膜中过剩的线粒体自噬数量，有利于减少自噬体的堆积，降低RGCs的凋亡。