SMAD4 基因单核苷酸多态性位点rs12958604 和rs10502913 与宫颈癌相关性研究

滕元姬 凌永嫦 王永亮 李美琴 王春芳 王俊利 杨凤莲

在全球范围内，宫颈癌是女性第四大常见癌症，每年有50 多万例女性确诊[1]。在中国，宫颈癌是仅次于乳腺癌的女性生殖系统第二大癌症，其发病原因虽证实与HPV 感染有关，但确切的机制仍不十分清楚[2-3]。SMAD4（mothers against decapentaplegic homolog 4）又名DPC4，是位于人类染色体18q21.1 的肿瘤抑制基因，由12 个外显子组成，编码552 个氨基酸序列，是转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGFβ）通路关键的细胞内转录因子，其缺失被认为是肿瘤细胞对TGF-β 产生抵抗的开始[4]。研究表明，SMAD4 基因突变与宫颈癌发生发展和不良预后相关，SMAD4 基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与胸主动脉瘤或主动脉夹层、溃疡性结肠炎、直肠癌、胰腺导管癌等多种肿瘤易感性密切相关[5-6]。本研究旨在通过采用病例对照研究的方法，探讨SMAD4 基因SNP 位点rs12958604 和rs10502-913 与宫颈癌易感性的相关性。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2018 年2 月至2019 年12 月右江民族医学院附属医院和广西医科大学附属肿瘤医院确诊的宫颈癌患者和同时期健康体检者血液样本各342 例，分为宫颈癌组和对照组，及包括年龄、民族、肿瘤类型、组织病理分级、肿瘤TNM 分期、是否淋巴结转移、是否远处转移等临床病理资料。纳入标准：宫颈癌组：1）经临床和病理组织诊断为宫颈癌；2）年龄≥18 岁。对照组：1）健康体检女性，年龄≥18 岁；2）纳入个体间无血缘关系；3）血液常规检查结果正常及HPV 检测结果阴性。排除标准：宫颈癌组与对照组：1）既往肿瘤史或合并其他肿瘤；2）合并其他系统性血液或自身免疫类疾病；3）有精神病史、有慢性病史、有肿瘤家族史。本研究获得右江民族医学院附属医院和广西医科大学附属肿瘤医院伦理委员会批准和患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 研究设计 采用病例对照研究方法，对宫颈癌组和对照组SMAD4 基因SNP 位点rs12958604 和rs10502913 频率差异进行比较，同时评估其他风险因素对病因的影响。

1.2.2 DNA 提取及 SNP 检测 收集血液样本2 mL/例，严格按照DNA 提取试剂盒（深圳亚能生物科技有限公司）说明书要求进行实验操作，提取血液样本中的DNA，-20°条件保存。采用imLDRTM多重SNP 分型试剂盒（上海天昊生物科技有限公司），使用多重PCR 反应对目标SNP 位点所在区段进行扩增。rs12958604 扩增引物上游为5'-CTAAGCCTTGATGAGTTGCT-3'，下游为5'-CTGCAAATTATATTATAGAT-3'；rs10502913 扩增引物上游为5'-TAGCCAATCCTGACTGATAC-3'，下游为5'-TTGTGCCAAGACCTAGGTTA-3'。采用ABI3730XL毛细管电泳分析扩增产物。

1.3 统计学分析

采用SPSS 24.0 软件进行统计学分析。各位点基因型、等位基因（计算方法例数加倍）、基因模型采用二元Logistic 回归分析，群体遗传学Hardy-Weinberg 平衡定律检验采用 χ2检验，阳性位点与其他风险因素采用多元Logistic 回归多因素分析，基因单倍型（计算方法例数加倍）采用在线SHEsis 软件分析。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征

宫颈癌组的中位年龄为51（23～79）岁，对照组的中位年龄为50（23～86）岁，两组年龄进行比较差异无统计学意义（P=0.060）。宫颈癌组中，鳞状细胞癌最多见，占 78.1%（267/342），其次为腺上皮细胞癌，占15.2%（52/342）。在宫颈癌TNM 分期中（Ⅰ+Ⅱ期）占64.9%（222/342），淋巴结转移占24.0%（82/342），远处转移占6.1%（21/342）。

2.2 基因型分析

SMAD4 基因SNP 位点rs12958604 和rs105029 13 分型显示，rs12958604 位点有AA、GA 和GG 基因型，rs10502913 位点有GG、GA 和AA 基因型（图1）。

图1 SMAD4 基因SNP 位点rs12958604 和rs10502913 测序图

2.3 基因型和等位基因与宫颈癌易感性分析

采用群体遗传学Hardy-Weinberg 平衡定律检验基因型频数，宫颈癌组rs12958604（χ2=0.943，P=0.332）和rs10502913（χ2=3.473，P=0.062）位点基因型符合Hardy-Weinberg 平衡定律；对照组rs12958604（χ2=1.996，P=0.158）和rs10502913（χ2=0.221，P=0.639）位点基因型亦符合。本研究结果显示，群体的遗传性能保持相对稳定，各等位基因的频率在遗传中基本保持基因平衡。rs12958604 位点GG 基因型、GG+GA 显性模型在宫颈癌组和对照组进行比较差异均具有统计学意义（均P＜0.05），G 等位基因在宫颈癌组中分布频率低于对照组，两组进行比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。rs10502913 位点的基因型和等位基因在两组中进行比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表1，2。

表1 rs12958604 和rs10502913 基因频率在宫颈癌组与对照组的比较

表2 rs12958604 和rs10502913 等位基因频率在宫颈癌组与对照组的比较

2.4 rs12958604 和其他风险因素与宫颈癌易感性的多元Logistic 回归多因素分析

SMAD4 基因SNP 位点rs12958604 和其他风险因素与宫颈癌易感性的多元Logistic 回归多因素分析结果显示，高血压为宫颈癌易感性的独立危险因素，而年龄、民族、高血脂、糖尿病与宫颈癌易感性进行比较差异均无统计学意义（均P＞0.05，表3）。

表3 rs12958604 和其他风险因素与宫颈癌易感性的多因素分析

2.5 SMAD4 基因SNP 位点 rs12958604 和rs105029-13 单倍型分析

采用SHEsis 软件进行rs12958604 和rs105029-13 单倍型分析结果显示，两组基因有3 种单倍型，分别为A-G、G-A、G-G，其中以G-A 单倍型为主。在宫颈癌组和对照组中，G-A 单倍型分别占50.6%（346/684）和57.9%（396/684），G-A 和G-G 单倍型在两组中进行比较差异均具有统计学意义（均P＜0.05，表4）。

表4 宫颈癌组和对照组中rs12958604 和rs10502913 单倍型比较

3 讨论

SMAD4 是基因编码信号转导蛋白SMADs 家族成员。SMAD4 连接激活域并整合WNT、FGF 和TGF-β 信号通路，经过多种途径被丝氨酸-苏氨酸受体激酶磷酸化后参与调节TGF-β[4]。TGF-β 通路上游有信号传递时，下游区SMAD4 基因可通过增强TGF-β信号来调节靶基因的表达[7]。SMAD4 基因缺失在胰腺导管腺癌中最常见，但也在如胃癌、结肠癌、肺鳞状细胞癌等恶性肿瘤中表达[8-9]。

本研究发现，SMAD4 基因 SNP 位点rs129586-04 的GG 基因型和GG+GA 显性模型及G 等位基因可能降低宫颈癌易感性；rs12958604 和rs10502913 单倍型分析显示，携带G-G 单倍型为风险因素，可能增加宫颈癌易感性，而G-A 单倍型可能降低宫颈癌易感性。本研究的多因素分析结果显示，高血压为宫颈癌易感性的独立危险因素。张璇等[10]对SMAD4 基因SNP 与鼻咽癌预后的相关性研究发现，rs12598604 位点GA/GG 型携带者3 年远处转移风险增高，而本研究并未发现该位点GA/GG 型与临床病理特征（远处转移、淋巴结转移）具有相关性，可能与rs12598604在鼻咽和宫颈组织中表达水平不同有关。Alghamdi 等[11]研究显示，SMAD4 基因在17.6%原发性宫颈腺癌中表达缺失，在95.8%黏液性上皮肿瘤（如宫颈、子宫内膜、卵巢）中表达降低。Yuan 等[12]研究发现，TGF-β 信号通路的上游TGFBR2 调节因子通过Hedgehog 信号失活上调SMAD4 表达，从而抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移。刘尧尧等[13]研究显示，miR-210-3p 通过靶向调控SMAD4 基因，可提高其蛋白表达水平，从而负向调控宫颈癌Hela 细胞的增殖、侵袭能力。本研究显示，SMAD4 基因 SNP 位点rs10502913 与宫颈癌易感性无相关性。Zhao 等[14]研究显示，SMAD4基因SNP 位点rs10502913 与中国汉族人群的煤炭工人尘肺病易感性无相关性。Wosiak 等[15]研究发现，SMAD4 基因SNP 位点rs10502913 与结直肠癌易感性无显著相关性。因此，SMAD4 基因无论是在TGFβ 信号通路中的连接、传递作用，还是与上、下游基因的相互调控作用，或是自身高度基因SNP，对细胞生长、增殖、分化等均起着不同的重要作用。

综上所述，本研究结果显示SMAD4 基因SNP 位点rs12958604 与宫颈癌易感性具有相关性。rs105029-13 与宫颈癌易感性不具有相关性，但该结果仍需更大样本量和更深层次的研究来进一步证实。本研究也存在如样本例数较少，未探讨区域环境因素与宫颈癌发生是否存在交互作用，缺乏对该基因在宫颈癌组织和癌旁组织样本中探讨等不足之处。扩展SMAD4 基因SNP 领域的数据是本课题未来研究的目的和方向，对临床早期诊断、个性化治疗将具有参考意义。SMAD4 基因与肿瘤相关性研究虽取得了一定进展，但仍处于起始阶段，其在肿瘤的早期诊断、预后和治疗中仍有较大研究价值。