180例不明原因智力障碍儿童的脆性X综合征检出情况▲

钟青燕 熊小波 曾 婷 王大永 吴勇聪 袁德健 蔡 稔 严提珍

[1 柳州市妇幼保健院医学遗传科，广西柳州市 545001； 2 柳州市出生缺陷预防与控制重点实验室，广西柳州市 545001； 3 柳州市妇幼保健院儿童保健科，广西柳州市 545001； 4 苏州新波生物技术有限公司，江苏省苏州市 201203； 5 珀金埃尔默医学诊断产品(上海)有限公司，上海市 215400]

智力障碍包括一系列以低智商、适应性行为和功能受限为特征的症状[1-2]。在全世界人群中智力障碍的患病率约为1%，严重智力障碍的患病率约为0.6%[3]。遗传因素是智力障碍发生的主要影响因素，由这一因素导致的智力障碍患者占85%[4]。其中，脆性X综合征(fragile X syndrome,FXS)是智力障碍常见的遗传因素。FXS的主要临床表现为不同程度的智力低下、孤独症、特殊面容(长脸、大耳朵、尖下巴)、男性巨睾等。FXS发病的主要分子机制是脆性X智力低下1( fragile X mental retardation 1,FMR1)基因5′端非编码区的三核苷酸重复序列CGG过度扩增[5]。既往关于FMR1基因的缺失和点突变的研究显示[6-7]，FMR1基因位于X染色体q27.3,全长38 kb，由17个外显子和16个内含子组成，编码FMR1蛋白，在其上游约250 bp处有一个CpG岛。美国人类遗传学学会指南[8]根据FMR1基因CGG序列的重复次数将其基因型划分为正常型、中间型(灰区)、前突变型和全突变型。其中，重复次数6～44次为正常型，FMR1基因可以正常表达，无临床表现；重复次数45～54次为中间型，无明显临床表现，子代可扩增为前突变型；重复次数55～200次为前突变型，约有20%携带前突变型FMR1基因的女性会发生卵巢功能不全或卵巢早衰，携带前突变型FMR1基因的部分男性和少部分女性由于X染色体失活，在成人期会出现脆性X相关性震颤/共济失调综合征；重复次数大于200次为全突变型，在男性FMR1基因发生全突变会导致CpG岛异常甲基化，抑制FMR1基因正常表达，导致FMR1严重减少或缺乏，表现为典型的FXS，也有 30%～50%携带全突变型FMR1基因的女性表现轻重程度不等的智力低下。由于FXS的临床表现复杂多样，且青春期之前的儿童临床表现不明显，因此需要借助基因诊断的方法对患儿进行早期诊断、早期干预。本研究运用PCR微流控毛细管电泳技术联合Southern印迹杂交法对FMR1基因进行CGG重复次数检测， 分析不明原因智力障碍儿童FXS的发病率，以期为本地区智力低下人群的FXS发生率研究提供参考数据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 纳入2017年12月到2020年5月期间在柳州市妇幼保健院就诊的所有不明原因智力障碍儿童(180例)及部分FMR1基因突变患儿的家系成员(2个家系共5例)。180例儿童中男童145例、女童35例，年龄为1.39～11.92(3.81±1.77)岁。智力障碍的诊断标准：智力水平落后于同龄人平均智商两个标准差以上，即智商≤70分；存在适应性行为缺陷。本研究经柳州市妇幼保健院审查伦理委员会审批通过(20160227042)，研究对象和/或其监护人均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA样本准备：使用核酸提取试剂盒(苏州新波生物技术有限公司，批号：AQ20201001)，在Chemagic 360全自动核酸提取仪(苏州新波生物技术有限公司)上提取受试者外周血(200 μL)基因组DNA，提取的基因组DNA用于PCR检测。另使用QIAamp DSP全血DNA提取试剂盒(Qiagen公司，批号：166016522)提取基因组DNA，用于Southern印迹杂交。所有实验步骤严格按照说明书进行。

1.2.2 PCR微流控毛细管电泳技术：使用FMR1基因检测试剂盒(PCR微流控芯片毛细管电泳法，苏州新波生物技术有限公司，批号：AR20200901)进行FMR1基因突变分析。对受试者基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系共20 μL，包括FX反应液15 μL、FX稀释液3.8 μL、FX聚合酶0.2 μL、DNA模板1 μL。反应条件为95 ℃预变性5 min；98 ℃变性35 s，61 ℃退火35 s，72 ℃延伸4 min，共25个循环；72 ℃终延伸10 min。将获得的PCR产物进行核酸纯化，纯化后的PCR产物在LabChip GX Touch微流控毛细管电泳仪(苏州新波生物技术有限公司，型号：LabChip GX Touch)上进行PCR产物片段大小分析。本研究同时采用已知重复次数的参考样本(质控DNA，5个不同CGG重复次数的DNA片段，29/43/56/100/375 CGG重复次数)构建标准曲线，测定样本通过标准曲线换算得到更高精度的CGG重复数。

1.2.3 Southern印迹杂交法：将所有FMR1基因全突变型病例样本送到中南大学生命科学学院遗传研究中心进行Southern印迹杂交检测。

2 结 果

2.1 PCR微流控毛细管电泳技术检测结果 180例患儿中，检出FMR1基因全突变型4例(均为男童)、中间型1例、正常型175例，FXS检出率为2.22%(4/180)；正常型的CGG重复次数范围是12～44次，最常见的CGG重复次数是28次和29次。4例FMR1基因全突变型的家系中，家系1先证者CGG重复次数为190/248/370次，母亲为25次和134次，妹妹为39次和148/218/554次，姨妈为29次和29次；家系2先证者CGG重复次数为859次(此家系仅检测了患者)；家系3先证者CGG重复次数为529次，母亲为31次和76次，姐姐为29次和130次；家系4先证者CGG重复次数为525次(此家系仅检测了患者)。4例FMR1基因全突变型病例家系的临床表现及基因检测结果见表1，家系1的PCR微流控毛细管电泳检测结果图谱见图1。

2.2 Southern印迹杂交法检测结果 FMR1基因全突变型病例的样本经Southern印迹杂交检测验证，结果都显示有>5.8 kb条带(全突变条带)，与PCR微流控毛细管电泳检测基因分型结果完全一致，见表1。

表1 4例全突变型患儿及家系的临床表现和检测结果

3 讨 论

1977年Sutherland[9]最早采用G显带技术发现并证明了X染色体q27.3上存在脆性位点。该方法操作烦琐、费时、可靠性差，已逐渐被替代。1991 年Verkerk 等[10]应用定位克隆法在X染色体q27.3附近发现了FMR1基因，使FXS的诊断进入分子水平阶段。目前Southern印迹杂交法是FXS基因诊断的金标准，但该方法所需样本量大、检测通量低、操作复杂、耗时长、成本高，因而不适合用于常规筛查。最初的PCR只能检测正常和小片段前突变等位基因，对于大片段前突变型和全突变型基因，由于GC含量增高容易导致极高的Tm值，以及CGG重复次数增多容易形成稳定的二级结构，而不能很好地完成扩增。随着人们对FXS相关基因不断地了解和认识，PCR技术得到了不断的优化，这一难题逐步得到解决。本研究引用PerkinElmer专利技术，用一对跨越FMR1基因启动子5′非编码区CGG重复序列的特异性引物进行PCR扩增，获得包含全部CGG重复序列的PCR产物，PCR产物经过核酸纯化试剂盒的纯化后，使用全自动微流控芯片毛细管电泳仪通用试剂盒，在全自动微流控芯片毛细管电泳分析仪上分析DNA片段的大小，同时根据标准曲线计算出CGG重复次数，能实现对FMR1基因5′非编码区CGG重复序列的精确定量，从而准确区分正常型、中间型、前突变型、全突变型，可有效识别CGG重复次数高达1 400次的全突变型，整个过程仅需6 h，高效快速，方法简便易操作，适用于大规模人群筛查。本研究中，4例FMR1基因全突变型病例的样本经Southern印迹杂交法验证，均显示有>5.8 kb条带(全突变条带)，提示两种检测结果一致，表明PCR微流控毛细管电泳技术能有效检出FMR1基因全突变型。

本研究采用PCR微流控毛细管电泳技术对180例不明原因智力障碍儿童进行FMR1基因突变分析，结果显示正常型CGG重复次数范围为12～44次，最常见的等位基因重复次数是28次和29次，与Chen等[11]报告的结果相似。本研究中，180例不明原因智力障碍儿童的FXS检出率为2.22%，与Zhong等[12]在中国东、西、南、北、中部地区5个城市的1 127例智力低下患者中的FXS检出率(2.8%)相近。不同国家或地区报告的智力低下人群的FXS发生率差异较大：欧美发达地区的发生率一般在1%～4%之间[13-14]，巴基斯坦发生率为4.8%[15]；而在我国，叶志纯等[16]报告湖南省先天性智力低下儿童的FXS发生率高达8.05%，罗诗坤等[17]报告华南和华中等地区不明原因智力障碍患者的FXS发生率高达9.4%。产生这些差异的主要原因，笔者认为有以下几点：(1)虽然FXS影响全球所有种族，但由于种族差异，不同人群的患病率可能有所不同。(2)根据上述研究结果可以看出，发达国家智力低下人群的FXS发生率总体上低于发展中国家，可能原因是发达国家较早开展此方面的研究，比较重视智力障碍人群的遗传史和家族史，较早制定相应的指南规范，使得FXS得到较好的预防和控制，因此发生率相对更低。(3)各研究所纳入的人群不一样，FXS发生率差异比较大。本研究和Zhong等[12]纳入的人群均为不明原因智力障碍的儿童，而叶志纯等[16]纳入的人群为临床上高度怀疑为FXS的患者，且发育商在0～55分之间，罗诗坤等[17]纳入的人群是已经排除了染色体病、基因组病和遗传性代谢病的不明原因智力障碍患者，这大大缩小了纳入人群范围，故与本研究的发生率相差比较大。

总之，在不明原因智力障碍儿童中存在一定比例的FXS患儿。目前尚无有效治疗FXS的方法，用叶酸辅以营养神经和神经康复治疗可改善FXS患者的智力状况，年幼者效果更好。临床上应对疑似FXS的患儿进行基因诊断，尽早明确诊断后可以早期给予药物、行为、言语、心理等干预，从而提高患儿的生活自理能力，改善患儿的生活质量，减轻社会负担。同时，应对患儿家族成员进行基因诊断，为其提供遗传咨询和生育指导，避免此类患儿的出生。